Appunti Biologia del differenziamento

CFTR

Canale ionico del cloro. Fa parte della famiglia ABC di trasportatori ed è costituito da due domini

caratterizzati da TMD1 e TMD2 ciascuno costituito da 6 alfa-eliche con due domini in grado di legare ATP,

che consentono l’apertura del canale. Vi sono anche due domini regolatori NBD1 e 2 che vengono fosforilati.

Quando il dominio regolatore viene fosforilato da PKA permette il legame dell’ATP all’NBD1 che a seguito ad

idrolisi permette la parziale apertura del canale, ma anche NBD2 deve essere fosforilato per poter garantire

la corretta apertura del canale. Le varie mutazioni che avvengono in questo gene inducono modificazioni

all’interno delle varie porzioni della proteina. Quando CFTR viene prodotta viene integrata nel RE e a seguito

di modificazioni post-traduzionali viene rilasciata a livello della membrana: si ha una prima glicosilazione

dove la proteina aumenta il suo peso molecolare (banda B in western blot) e la proteina immatura viene

trasportata nel Golgi dove viene nuovamente glicosilata e acquisisce un nuovo peso molecolare e viene

quindi trasportata sulla membrana cellulare dove svolge la sua funzione. La proteina nella sua forma

immatura può essere ubiquitinata e degradata all’interno del proteasoma quando non ha un corretto

folding, cosa che succede soprattutto quando si hanno mutazioni.

Ci sono circa 2mila mutazioni e sono caratterizzate in

- Classe I: Mutazioni con codoni di stop -> no CFTR

- Classe II: missfolding della proteina che viene ubiquitinata e degradata nel proteasoma Phe508 e

colpisce il 70/90% dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Un minimo di CFTR in membrana riesce ad

arrivarci, ma comunque risulta essere non funzionale (mutazione delta F508)

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- Classe III: difetto di regolazione, dove a livello dei domini NBD1 e 2 non si ha un legame corretto

con ATP che non viene idrolizzato. Colpisce il 3% dei pazienti affetti da fibrosi cistica.

- Classe IV: la proteina è presente ma ha una funzione ridotta con riduzione del trasporto del cloro

- Classe V: dovuta a difetti di splicing, ma una piccola quantità di CFTR viene tradotto

correttamente

- Classe VI: difetti nel turnover del CFTR. Esso ha un’emivita di 12 ore e si ha un turnover più

accelerato.

La fibrosi cistica è una malattia multiorgano e si hanno degli effetti primari che sono a carico delle vie aeree

e dell’apparato gastro-intestinale (intestino, pancreas (deficienza di insulina), ecc.). ad oggi si sono aggiunti

degli effetti secondari come ad esempio a deficit della crescita, osteoporosi, diabete, ecc.

Sintomi respiratori

I polmoni dei bambini appena nati sono normali. Si riesce a capire che il bambino è malato quando i polmoni

sono molto infiammati, infettati e all’interno del fluido si riscontrano numerosi polimorfonucleati.

L’infezione cronica delle vie aeree porta ipossiemia, ipercapnia che portano all’insufficienza polmonare che

è la causa di morte dell’80% dei pazienti affetti da fibrosi cistica. I bambini affetti da fibrosi sono infettati da

Haemophilus influenzae o S. aureus e infine da P. aeruginosa che attiva il sistema immunitario in maniera

esagerata che richiama i neutrofili che rilasciano molta elastasi che porta alla distruzione del tessuto.

Circa il 15% dei bambini affetti da fibrosi cistica hanno peritonite e prolasso rettale. Circa l’85-90% dei

bambini hanno insufficienza pancreatica. Come effetti secondari si hanno anemia, neuropatia, osteoporosi.

Si hanno anche disordini a livello endocrino con ostruzioni dei dotti intra-pancreatici, che possono portare

alla distruzione dell’organo. Il danno a livello del pancreas porta al diabete mellito da fibrosi cistica. Il dotto

deferente è molto sensibile alla disfunzione del CFTR. Praticamente tutti gli uomini con classica fibrosi cistica

hanno azoospermia e sono infertili (95%) a causa dell'assenza bilaterale congenita dei dotti deferenti, che

può essere vista anche negli uomini con una sola mutazione CFTR e senza altre manifestazioni di fibrosi

cistica. Le donne con fibrosi cistica sono fertili.

Le carenze di vitamina D portano all’osteoporosi e inoltre anche i vasi sono sensibili alle mutazioni di CFTR.

Diagnosi

Nel neonato lo si può notare dall’ileo da meconio, protratto ittero, calcificazioni addominali e scrotali, atresia

intestinale. Nel caso di infanti si hanno infiltrati infiammatori polmonare, crescita lenta, diarrea cronica,

polmonite da staphylococcus auereus, ipertensione endocranica idiopatia (carenza di vitamina A) e anemia

emolitica (carenza di vitamina E). Vengono fatti test pre-natali con amniocentesi e villocentesi con successivo

sequenziamento genico. A seguito della nascita si ha un prelievo di sangue dal tallone. Nei neonati con FC

sono presenti elevati livelli di tripsinogeno a causa della penetrazione nel sangue delle secrezioni

pancreatiche a seguito del blocco del dotto pancratico. Tuttavia questi livelli elevati diminuiscono in modo

relativamente veloce dopo la nascita ed il test non può più essere più svolto in modo attendibile dopo il 1°

mese di vita. Va ripetuto dopo 20-30 giorni per evitare falsi positivi-accompagnato da test genetico.

Un altro test è quello del sudore che consente di porre la diagnosi di FC attraverso una misurazione del cloro

e del sodio presenti nel sudore, sempre elevati nei pazienti con fibrosi cistica. L’esame dura circa 40 minuti,

è indolore, non richiede alcuna preparazione. Il test consiste nella stimolazione della sudorazione sulla parte

volare dell’avambraccio tramite ionoforesi pilocarpinica della durata di 5 minuti. Successivamente il sudore

prodotto viene raccolto ed analizzato. I valor di riferimento della letteratura per il cloro nel sudore indicano

60mEq/L come limite al di sopra del quale il test è ritenuto positivo e il sospetto di Fibrosi Cistica è

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confermato. Con valori di cloro al di sotto di 40 mEq/L il test è da ritenersi negativo, nel lattante al di sotto

dei 30 mEq/L. Gold standard.

Può essere effettuato anche la Misurazione della differenza di potenziale tramite due elettrodi posti sulla

cute e sulla mucosa nasale. Valore sempre negativo, normalmente -20mV, nei Pazienti FC -40/60mV più

negativo per aumento riassorbimeno Na+ non inibito opportunatamente da CFTR. Test innovativo e sempre

più utilizzato.

Terapie

- Microbiologico: in modo da ridurre le infezioni

- Biochimici, farmacologi: in modo da capire i difetti a livello del CFTR in modo da disegnare farmaci

appositi per quel difetto

- Terapia cellulare: iniettare cellule con CFTR sano in modo da ricostituire la normale funzione a

livello polmonare.

Il primo tipo di terapia, più convenzionalmente usato, che ha portato all’aumento dell’aspettativa di vita (ma

cura la sintomatologia e non la causa) è l’uso di antibiotici, in modo da combattere Pseudomonas

(aztreonam, clostimethate). L’uso di antibiotici causa resistenza. Assieme agli antibiotici si affianca l’suo di

anti-infiammatori, che aumenta i livelli di nerleuchina 10. Ad oggi non vengono più usati corticosteroidi in

quanto non portano ad effetti migliori e bloccano la crescita. Si hanno anche trattamenti di tipo mucolitico.

Si usa anche la dornase alfa in quanto il muco è costituito anche da DNA che viene rilasciato sia dai batteri

che dalle cellule ciliate ed immunitaria. In questo modo si rende il muco meno viscoso. Si usano anche

soluzioni ipertoniche in modo da re-idratare il muco e anche il mannitolo in modo da incrementare l’attività

delle ciglia. Si ha una terapia sostitutiva di enzimi pancreatici, supplementi di vitamina dovuti al mal

assorbimento. Nel caso in cui tutto questo non bastasse si va incontro al trapianto di polmone, che però

causa immunodeficienza. Tutto questo va a colpire le conseguenze della fibrosi cistica e non la causa.

Ad oggi si cerca di trovare un approccio in modo che colpisca la causa della malattia, con processi che portano

all’espressione corretta della CFTR. Attualmente si hanno correttori e potenziatori, ma non sono applicabili

a tutti i tipi di pazienti

- Correttori permettono alla CFTR di essere correttamente foldata

- Potenziatori non agiscono sul folding del CFTR ma sui difetti di apertura del canale (classe III).

Utilizza ivacaftor che porta ad un aumento del 10% della FEV1 (indice della capacità polmonare),

induce la diminuzione di Cl- nel sudore (50mmol/L), riduzione delle esacerbazioni polmonari (che

si hanno quando si ha muco denso nei polmoni), aumento del peso, condizioni di vita migliori.

Questo farmaco funziona solo sul 5% dei pazienti affetti da FC. Vengono utilizzati anche in pazienti

di classe IV, ma il miglioramento è modesto.

- Correttore + potenziatore: si cerca di garantire il folding corretto della proteina e si potenzia la

sua attività. Questa combinazione dà luogo all’Orkambi. Questo tipo di approccio è indicato per i

pazienti di classe II. I benefici terapeutici non sono entusiasmanti: 3% del recupero della FEV1,

riduzione del 35% delle esacerbazioni polmonari, indicazioni su diminuito declino polmonare,

aumento della clearance polmonare, diminuita concentrazione di cloro nel sudore. Uno dei

problemi di questa terapia deriva dagli eccessivi costi.

- Cercando di migliorare la terapia con Orkambi, si sono usati ivacaftor con tezacaftor dove si ha

un aumento del 6.8% della FEV1, riduzione del 35% delle esacerbazioni polmonari, significativo

aumento dell’indice della massa corporea, migliore qualità della vita.

- Si sta cercando di aggiungere al potenziatore e al correttore un ulteriore correttore al CFTR, ma

questo farmaci sono ancora in fase seconda dei trial.

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- Utilizzo di oligonucleotidi di RNA modificati e sono ancora in fase I preclinica. Sono in grado di

inserire nel messaggero mutato le 3 basi delete che causano la mutazione. Nei studi preclinici in

topi la somministrazione viene fatta per via inalatoria, che però non garantirebbe il corretto

assorbimento a causa del muco. Ma nonostante questo, l’emivita del farmaco è molto elevata

che permette anche una somministrazione di tipo sistemica. La potenzialità di questo farmaco è

che questi oligonucleotidi possono essere utilizzati non solo per una specifica mutazioni ma anche

per altre patologie genetiche.

- Farmaci read-through: farmaci in grado di legarsi al ribosoma, modificandone la conformazione

in modo da fare skeeping creando codoni di stop e portando alla traduzione di CFTR in pazienti

affetti con mutazioni di tipo stop codon. Uno di questi farmaci è la Ataluren (usata anche in

Duchenne) ma in fase 3 non ha portato a risultati positivi.

- Stabilizzatori proteici: aumentare la localizzazione in membrane di CFTR e la sua stabilità in modo

da aumentare la quantità di CFTR soprattutto in questi pazienti dove non viene prodotta. Questo

tipo di farmaco è arrivato in fase seconda, in modo da potenziare, correggere e stabilizzare il

CFTR, ma