Appunti Biologia del differenziamento

Medicina rigenerativa

Medicina rigenerativa: curare una patologia che causa la degenerazione del tessuto.

Esame scritto e orale

Esame scritto (1 domanda aperta con 5 domande a scelta multipla. 5 punti per la domanda aperta e voto indecimi e punto di partenza per l'orale) e orale:

• 22 gennaio 2018
• 9 e 23 febbraio 2018
• 11 giugno 2018
• 2 e 18 luglio 2018
• 17 settembre

Testi: Gilbert-Biologia dello sviluppo (Zanichelli) + slides.

Tessuto

Aggregati o gruppi di cellule organizzati con lo scopo di svolgere una o più funzioni specifiche. Composto da gruppi di cellule che condividono uguale struttura e funzione.

Determinazione (Commitment)

Cambiamento stabile della cellula dovuto a variazioni dell’espressione genica. Dove la cellula spegne alcuni geni e ne accende altri. Alla determinazione farà seguito il differenziamento.

Differenziamento

Cambiamento stabile irreversibile, come la determinazione, ma rappresenta la fase terminale della cellula. A monte della determinazione vi è la specificazione, un commitment più blando, in quanto la cellula può tornare indietro, mentre la determinazione è più irreversibile. Il processo di differenziazione cellulare avviene già nello stato embrionale. Ad esempio nel muscolo scheletrico quando si ha lo sviluppo dei sincizi è differenziato. Tutte le cellule comunicano tra di loro, anche di tessuti diversi, attraverso fattori paracrini, oppure attraverso il contatto diretto cellula-cellula, in questo caso entrano in gioco le molecole di adesione che servono a trasmettere segnalazione a valle.

Giulio Bizzozzero: cellule labili, stabili e perenni

Fu il primo a capire che, anche raggiunta l’omeostasi cellulare, la cellula è in grado di rigenerarsi anche in cellule diverse. Scoprì che l’eritropoiesi/leucopoiesi ha luogo nel midollo osseo [1868]; scoprì le piastrine. Per di più, Bizzozero comprese che il rinnovamento cellulare varia nei diversi tessuti. Classificò le cellule in labili, stabili e perenni, in base al loro potenziale rigenerativo.

• Tessuti labili: costituiti da cellule indifferenziate, dalla vita breve (da pochi giorni a qualche settimana), sono caratterizzati dalla capacità di rinnovare continuamente gli elementi cellulari morti; appartengono a tale tipo di tessuti gli epiteli di rivestimento e il sangue. Questi hanno una nicchia di cellule staminali molto attiva.
• Tessuti stabili: rigenerano solo in seguito ad un danno. Le loro cellule staminali sono in quiescenza. Esempi: tessuto muscolare scheletrico, tessuti connettivi, tessuti ghiandolari epiteliali, tessuto osseo. Sono costituiti da cellule che, raggiunta la differenziazione al termine dell’accrescimento, cessano di moltiplicarsi, tendendo a conservarsi stabilmente; in caso di lesioni possono riacquistare la capacità di riprodursi per riparare o sostituire la parte di tessuto morto. Una volta che il danno è stato riparato, la cellula staminale ritorna a preservare la nicchia.
• Tessuti perenni: sono tessuti che hanno una bassissima capacità rigenerativa e quando esiste è fallimentare. Ad esempio: tessuto nervoso e tessuto cardiaco. Hanno nicchie staminali, ma non si ha convergenza di opinione, ad esempio in quelle del cuore. Sono costituiti da cellule che si differenziano precocemente, durante lo sviluppo embrionale, crescendo poi soltanto di volume, ma non più di numero, nelle successive fasi dello sviluppo corporeo, incapaci quindi di sostituire gli elementi cellulari distrutti o danneggiati.

Tutte le cellule del nostro corpo hanno lo stesso numero di geni. La differenza tra una cellula e l’altra è la diversa espressione genica. Per questo motivo le cellule staminali embrionali sono poco usate, perché non sapendo dare istruzioni corrette portano alla formazione di tumori. Il più delle volte si hanno terapie combinate dove si sfruttano cellule staminali con terapie geniche e farmacologiche. Il farmaco ha una struttura nota e da sempre è sempre stato l’approccio più semplice per curare le malattie. Il farmaco non cura le cause della patologia in quanto il 98% dei farmaci cura l’effetto della malattia. Lo scopo del farmaco è quello di ritardare la patologia e di renderla più tollerabile.

Trial clinico

La definizione di trial clinico è sempre associato allo sviluppo del farmaco. Ma dall’introduzione di terapie alternative si utilizza il termine agente terapeutico. Nel trial si cerca di utilizzare modelli preclinici in modo da creare le corrette condizioni in cui si può utilizzare l’agente terapeutico. Una volta testato sul modello preclinico si testa il dosaggio. Quando il modello preclinico è ottimale si procede con il trial clinico nel paziente.

Il trial indica il percorso per l’autorizzazione e messa in commercio di un farmaco o di un approccio terapeutico, come ad esempio l’exon skipping. Il trial clinico è un protocollo di sperimentazione sugli esseri umani che ha lo scopo di determinare l’efficacia ed i possibili effetti collaterali di un farmaco o di una terapia.

• Fase preclinica (3-4 anni): studio in laboratorio su culture cellulari in vitro o su modelli animali. Si testa il meccanismo d’azione, tossicità, protocollo di somministrazione. La validazione di questa fase è data dalla pubblicazione scientifica.
• Studio sull’uomo
  • Fase 1: valutazione degli eventi avversi e sicurezza su volontari sani (ma dipende dall’agente terapeutico, ad es. se l’agente patogeno è una cellula o una cellula+ virus è importante l’infiammazione in quanto se il paziente è sano l’agente terapeutico finisce negli organi filtro come fegato, reni e polmoni. Con l’infiammazione, i macrofagi rilasciano citochine che richiamano le cellule e in questo modo l’agente terapeutico può arrivare al sito di danno). In questa fase si valutano il meccanismo d’azione, la farmacocinetica, sicurezza e tollerabilità.
  • Fase 2: si attua su un numero di pazienti più o meno ristretto, a seconda se la malattia è rara o meno. Si usano dosi diverse. In questa fase si valuta l’efficacia del farmaco.
  • Terapia autologa: uso delle mie stesse cellule.
  • Terapia eterologa: cellule esterne, ma non sono tue.
  • Questi trial sono a doppio cieco, in modo da non influenzare né il paziente né il ricercatore. Il doppio cieco non si fa per le malattie rare, perché la malattia è rara e perché ci sono pochi campioni. La coorte di pazienti deve essere sufficientemente numerosa per poter fare statistica. Per ogni esperimento è fondamentale sviluppare controlli giusti. In alcuni selezionati centri ospedalieri dotati di comitati etici di controllo, che devono autorizzare sia il protocollo generale di sperimentazione che ogni singolo passo della sperimentazione stessa, si realizza una serie di studi sul campo, che comprendono sia una ulteriore affinamento dell’analisi sulla tossicità e sugli effetti collaterali sia degli studi in doppio cieco su pazienti, per misurare di quanto l’effetto del nuovo farmaco sia superiore all’effetto placebo, considerato come una specie di "zero farmaceutico". Ogni paziente che partecipa alla sperimentazione deve essere informato puntualmente degli effetti del nuovo farmaco e dei potenziali rischi previsti, e firmare una dichiarazione di consenso informato.
  • Fase 3 o multicentrica: tutto deve essere standardizzato. Questo è il grande ostacolo per lo sviluppo di agenti terapeutici cellulari, in quanto risulta molto difficile standardizzare.
• Approvazione del farmaco: vi è sempre una farmaco vigilanza (follow up).

Terapie farmacologiche

Un farmaco è una sostanza esogena organica o inorganica, naturale o sintetica, capace di indurre modificazioni funzionali in un organismo vivente, positivamente o negativamente, attraverso un'azione fisica, chimica o fisicochimica. Un farmaco può essere utilizzato o somministrato allo scopo di ripristinare, correggere, modificare funzioni fisiologiche, esercitando un'azione farmacologica, immunologica o metabolica. Ogni nuovo farmaco nasce dall'individuazione, da parte dei medici e dei ricercatori, di un'ipotesi di bersaglio farmacologico, ossia un meccanismo o un processo biologico su cui intervenire per modificare il decorso di una malattia. Il farmaco cura gli effetti della malattia, fatta eccezione per alcune malattie che sono in grado di correggere la patologia.

Terapia genica

Intervento terapeutico basato sulla modificazione del patrimonio genetico di una cellula somatica, allo scopo di correggere un difetto genetico o di fornire una nuova funzione biologica per combattere una patologia. Può essere utilizzata da sola, in vivo, oppure ex vivo. In vivo, l’agente terapeutico è il gene e lo clono in un vettore virale. L’ex vivo consiste nel prelevare le staminali, le correggo geneticamente e le inserisco nel paziente.

La terapia genica si propone di intervenire alla base di un difetto genico nelle malattie genetiche attraverso:

• Gene editing correggendo il difetto genico
• Gene replacement dove si introduce la funzione che manca

I vettori che vengono utilizzati per l’introduzione del cDNA sono vettori virali e non virali.

Obiettivi della terapia genica

• Malattie genetiche: immunodeficienze, emofilia, talassemia, distrofia muscolare, genodermatosi, malattie lisosomiali, fibrosi cistica
• Malattie metaboliche autoimmuni: diabete, sclerosi multipla
• Tumori
• Malattie virali AIDS

La terapia genica può essere condotta:

• In vivo: introduzione di informazione genetica, sotto forma di un vettore virale o altro, direttamente nel paziente
• Ex vivo: introduzione di informazione genetica, sotto forma di un vettore virale o altro, in cellule o tessuti prelevati da un paziente e successivamente ri-impiantati

La terapia genica può essere

• Additiva (gene replacement): ripristino la funzione mancante. Introduzione di una copia funzionale del gene difettivo per ripristinarne la funzione o introduzione di nuove funzioni
• Sottrattiva (gene targeting): inattivo un gene o ne inibisco l’espressione
• Correttiva (gene editing): modificando la sequenza di un gene mutato, che può causare un’alterata funzione, localizzazione ecc.

Il successo della terapia genica è basato su:

• Efficiente trasferimento genico nella cellula bersaglio
• Appropriato livello di espressione del transgene
• Persistenza dell’espressione genica
• Regolazione dell’espressione genica
• Tolleranza immunitaria verso il prodotto del transgene
• Biosicurezza

Vettori genetici

• Vettori non virali (non più usati), DNA “nudo”, DNA coniugato con poli-lisina, lipidi cationici
• Vettori virali: retrovirus (MoLV), adenovirus, virus adeno-associati, virus erpetici, lentivirus

I virus possono essere a DNA o RNA, doppio o singolo filamento, che portano l’informazione genica che gli consente di esprimere le proteine del capside che sono quelle che danno la capacità infettante del virus, in quanto si legano alle cellule.

• Virus integranti: si integrano nel genoma della cellula
• Virus non integranti: rimangono in forma episomale

Lo scopo del virus è infettare la cellula per riprodurre sé stesso.

• Virus litici: per uscire dalla cellula la devono uccidere
• Virus lisogeni: per uscire dalla cellula gemmano

I virus vengono usati per veicolare il gene terapeutico nella cellula. I virus vengono attenuati, eliminando i geni di virulenza (geni necessari per la sua replicazione) e clono il gene terapeutico. Il vettore virale deve mantenere la capacità infettante di entrare nella cellula. Il virus che entra nella cellula integrerà il suo genoma nella cellula ospite, andando a replicare solo il gene terapeutico. GAG, POL, ENV geni più importanti di virulenza nei lentivirus che vengono tolti. Quando si produce il vettore virale si inseriscono le proteine ENV in quanto erano state tolte. Quando si producono i vettori virali si forniscono in trans i geni per l’envelope al paziente, attraverso cellule packing.

Vantaggi:

• Efficienza di trasferimento genico
• Assenza di tossicità
• Espressione del gene trasferito Elevata
  • A lungo termine
  • Selettiva per certi tipi di tessuto
  • Regolabile
  • Endogena

Lo svantaggio del gene therapy è che possono infettare tessuti sani. Bisogna quindi rendere selettiva l’espressione di un gene, grazie a promotori tessuti specifici. Se il virus si integra a monte di un protooncogene può portare allo sviluppo di tumore. Il virus ha come svantaggio gli effetti off target. Un modo per evitare questo effetto è quello di usare virus che hanno un tropismo specifico rispetto che un altro. Se si usa un virus non integrante in tessuti labili, al secondo terzo ciclo lo si perde. Se si infetta un tessuto stabile e/o perenne risulta essere più vantaggioso.

Rischi di un vettore virale

• Tossicità
  • Dipendente dall’espressione dei geni virali
  • Dipendente dalle particelle virali
• Patogenicità
  • Contaminazione con virus di partenza o con ricombinante capace di replicazione
• Rischi immunitari
  • Risposta anti-vettore
    • Anticorpale: può impedire somministrazioni ripetute
    • Cellulare: può distruggere le cellule modificate se esprimono qualche gene virale (anche se attenuato)
  • Risposta anti-gene trasferito:
    • Può neutralizzare attività del prodotto genico (anticorpi o cellule citotossiche)
    • Può scatenare autoimmunità
• Mutagenesi inserzionale (vettori integranti)

È sempre preferibile usare ex-vivo, in quanto ho il controllo di cosa ho corretto geneticamente e introducendo una staminale questa rimane per tutta la vita. Le staminali sono particolari in quanto hanno una divisione asimmetrica, dove si ha la formazione della figlia che ritorna alla nicchia.

Vettori retrovirali

• Vantaggi: elevata efficienza di infezione: integrazione nel genoma della cellula target ed espressione permanente del transgene; stabilità strutturale
• Dimensione del transgene <7kb
• Svantaggi: mutagenesi inserzionale (hot spots regioni dove sono presenti protoncogeni), incapacità di infettare cellule quiescenti. Infettano solo cellule proliferanti (quindi si scartano i neuroni)

Vettori lentivirali (Retroviridae)

• Vantaggi: presenta gli stessi vantaggi dei retrovirus ed è in grado di infettare anche cellule quiescenti
• Dimensione del transgene 7-10 kb
• Svantaggi: possibilità di indurre mutagenesi inserzionale. Meno pericolosa dei retrovirus (no hotspots). Presentano una cattiva reputazione (originano dal virus HIV)

Vettori adenovirali (Adenoviridae)

• Vantaggi: elevata efficienza di infezione; infettano anche cellule quiescenti (fegato e muscolo); applicazione per terapia genica in vivo
• Dimensione del transgene 8-35kb
• Svantaggi: tossicità acuta; risposta immune; dose-dipendente contro le proteine del capside; non integrano il transgene nel genoma della cellula target; difficoltà nella produzione su larga scala.

Vettori adeno-associati (Parvoviridae)

• Vantaggi: infettano anche cellule quiescenti, danno integrazione sito-specifica nel cromosoma 19 umano, mediata dalla proteina ricombinasi Rep; applicazione per terapia genica in vivo
• Tessuto-specificità: sierotipi AAV-9 muscolo scheletrico
• Svantaggi: sono in grado di veicolare nel proprio genoma solo geni molto piccoli (<<4kb) bassa efficienza di produzione di particelle infettanti.

Cellule staminali e applicazioni terapeutiche

Staminale deriva dal latino 'stamen' (genitivo: staminis) ed indica il “tronco” da cui hanno origine i rami. Per traslato, indica un'entità che dà origine ad altre forme ad essa simili. Sono diverse le prospettive per le cellule staminali; sviluppo di farmaci e test di tossicità, esperimenti per studiare sviluppo e regolazione genica, tessuti e cellule per la terapia.

Proprietà delle cellule staminali

Una cellula staminale è una cellula che:

• Non è terminalmente differenziata
• Può dividersi un numero indeterminato di volte (spesso durante tutta la vita di un organismo)
• Può generare cellule figlie destinate al differenziamento o a rimanere staminali

Il concetto di staminalità è quindi legato a:

• Potency: cellula in grado di diventare qualsiasi cellula del nostro corpo (plasticità o potenziale differenziativo)
• Self-renewal: cellula in grado di automantenersi. Per potersi automantenere attua un processo di divisione mitotica diversa, ossia la divisione asimmetrica. Quando si divide, una cellula figlia torna alle caratteristiche di staminalità e non intraprende un programma differenziativo, mentre l’altra cellula figlia intraprende un percorso differenziativo. Queste due cellule figlie esprimeranno geni diversi. La cellula staminale può entrare in gioco sempre (tessuti labili) o a seguito di un danno (tessuti stabili).

La cellula figlia che non ritorna alla nicchia di staminali inizia a dividersi in modo simmetrico generando cellule figlie identiche, in modo da espandersi e ricreare il tessuto. Questa fase prende il nome di transit amplifying cell.

Cosa determina quale delle due cellule figlie rimane staminale e quale differenzia?

• Fattori ambientali
• Determinanti asimmetricamente segregati: vi saranno all’interno della cellula madre dei fattori che si distribuiscono in modo diseguale. Non solo si segregano proteine in modo diseguale, ma anche il DNA viene segregato in modo asimmetrico.