Appunti Biochimica e applicazioni biotecnologiche nella patologia

Biochimica e applicazioni biotecnologiche nella patologia

La vita esiste perché esistono delle strutture (proteine, acidi nucleici, membrane) e delle informazioni contenute nel materiale genetico che consentono di avere delle entità che si riproducono, che si muovono, che lavorano e che necessitano di energia per la loro organizzazione. In particolare, gli organismi autotrofi ottengono energia in maniera autonoma, mentre gli eterotrofi necessitano di processare le molecole prelevate dall’esterno.

N.B. Il fabbisogno energetico umano giornaliero è pari a 2.000-3.000 Kcal (corrispondono a circa 12.000 KJ).

Metabolismo energetico

Quando una molecola di ATP viene idrolizzata, cioè quando è idrolizzato un solo legame fosfodiesterico, avviene un rilascio di energia pari a 30 KJ/mol; generalmente, si parla di equivalenti di ATP perché solitamente la molecola idrolizzata nella sintesi proteica è il GTP. Il consumo medio giornaliero di equivalenti di ATP per un individuo adulto è pari a 400 moli e, considerando che la massa molecolare di una molecola di ATP è di 500 grammi, sono necessari quotidianamente circa 200 Kg di ATP (quindi le cellule devono rigenerare ATP alla velocità con la quale viene consumato); in particolare, circa 1/3 di ATP è utilizzato dalla pompa Na⁺/K⁺-ATPasi che permette la rigenerazione del potenziale di membrana.

Ossidazione e trasportatori di elettroni

La maggiore quantità di energia utilizzata dalle cellule viene prodotta grazie all’ossidazione completa dei substrati in cui sono coinvolti i trasportatori degli elettroni che sono il NAD⁺ o nicotinammide-adenindinucleotide. Questo viene ridotto prelevando un idruro dal substrato ed un protone per formare NADH, liberando un H⁺. Il FAD o flavin-adenindinucleotide è ridotto prelevando due atomi di idrogeno per formare FADH₂. Il potenziale redox della coppia NAD⁺/NADH ha un valore di -0,32 V, mentre quello della coppia FAD/FADH₂ è -0,21 V, quindi il NAD⁺ si riduce più facilmente per ossidare i substrati.

N.B. Quanto minore è il valore del potenziale redox, tanto maggiore è la capacità ossidante della sostanza, cioè la sua facilità a ridursi per ossidare un substrato.

Struttura e funzione del NAD⁺ e FAD

Per quanto riguarda la struttura del NAD⁺, il suo sito reattivo è costituito da un anello aromatico di tipo pirimidinico in quanto l’atomo di H che si trova vicino al carbonio indicato dalla freccia ha una maggiore induzione di carica grazie alla vicinanza con un gruppo amminico ed un minore ingombro sterico; interviene nelle reazioni di ossidoriduzione in cui è in gioco un’alta quantità di energia (ad esempio quando sono coinvolti un atomo di ossigeno ed un atomo di carbonio). Il FAD presenta due atomi di azoto all’interno di due anelli alifatici che possono legare i due atomi di idrogeno ed interviene nelle reazioni di ossidoriduzione a minore energia (ad esempio quando sono coinvolti due atomi di carbonio).

Carica energetica

La carica energetica (C.E.) è un parametro empirico che è espresso dal rapporto fra la somma della concentrazione dell’ATP e di metà della concentrazione dell’ADP e la somma delle concentrazioni di ATP, ADP e AMP; ha un valore pari a 0.8-0.9 e corrisponde allo stato energetico della cellula.

N.B. Tutti i nucleotidi coinvolti sono interconvertibili tra di loro grazie all’azione dell’enzima adenilatochinasi (o miochinasi) e nucleoside disfosfato chinasi.

Produzione di ATP

L’ATP può essere prodotto anche dalla creatina chinasi (CPK) che è un enzima ubiquitario che consente di trasformare la fosfocreatina in creatina in breve tempo per mantenere costante il rapporto ATP/ADP della cellula (utilizzato nelle indagini diagnostiche); l’idrolisi della fosfocreatina permette la liberazione di una quantità di energia pari a -43 KJ/mol (presenta un ΔG°’ superiore a quello dell’ATP, quindi è utilizzata come molecola di riserva energetica per avere disponibilità immediata di energia). Sono presenti tre diverse isoforme citoplasmatiche prodotte da due geni diversi codificanti per le subunità B (brain) e M (muscle), quindi l’isoforma BB è presente nel cervello e nel muscolo embrionale, l’isoforma MB è presente nel cuore dei mammiferi e l’isoforma MM è presente nel muscolo adulto; inoltre, sono presenti due isoforme mitocondriali localizzate a livello dello spazio intermembranario dette MitA ubiquitaria e MitB sarcomerica che permettono la rigenerazione dell’ATP che fuoriesce dal mitocondrio.

Potenziale di fosforilazione

Il potenziale di fosforilazione ΔG′ è rappresentato dal ΔG ed è un indice dell’energia disponibile che può essere libera nella cellula dall’idrolisi dell’ATP.

Questo valore è variabile a seconda del tipo cellulare, ad esempio negli eritrociti ha un valore di -52 KJ/mol, mentre nel muscolo è superiore a -60 KJ/mol. La capacità fosforilante indicata dalla carica energetica e dal potenziale di fosforilazione è una misura della disponibilità energetica contenuta nell’ATP che rappresenta la principale forma di energia per le funzioni e le necessità delle cellule; questo fattore dipende dall’energia libera standard (è circa -30,5 kJ/mol per l’idrolisi dell’ATP), dalla quantità di ATP rispetto ai nucleotidi difosfato e monofosfato e dal tipo di cellula (infatti, nel muscolo scheletrico e cardiaco vi è un’elevata concentrazione di ATP rispetto a quella di ADP e AMP che fa raddoppiare il potenziale fosforilante rispetto al potenziale di riferimento standard, mentre negli eritrociti in cui la richiesta energetica è bassa il potenziale fosforilante supera di poco i 50 kJ/mol).

Il metabolismo glucidico

Il metabolismo glucidico prevede la degradazione dei carboidrati introdotti dalla dieta come amido (costituito da amilosi e amilopectina), glicogeno, disaccaridi e monosaccaridi, accumulati come riserve di glicogeno soprattutto a livello del fegato e del muscolo (in misura minore anche nel cervello) o come glucosio presente nei liquidi interstiziali e nel sangue (dove la sua concentrazione deve essere mantenuta costante).

Trasportatori del glucosio

• GLUT1 (ubiquitario) e GLUT3 (cervello) sono trasportatori con una K_m bassa di 1 mmM quindi essi funzionano sempre perché la concentrazione ematica di glucosio è circa 4,5-5 mM e sono in grado di far internalizzare glucosio per gradiente di concentrazione in modo che nelle cellule esso sia fosforilato a glucosio-6-fosfato (la concentrazione cellulare di glucosio rimane bassa).
• GLUT2 (fegato, pancreas, intestino) ha una K_m alta di circa 15-20 mM quindi in condizioni normoglicemiche la capacità di trasporto è molto bassa (il pancreas è responsivo ad alte concentrazioni di glucosio per permettere la secrezione di insulina).
• GLUT4 (muscolo, tessuto adiposo) ha una K_m di 5 mM quindi in condizioni normoglicemiche presentano una capacità di trasporto modesta anche perché si trova in bassa quantità espresso in membrana; tale trasportatore si trova in alta concentrazione all’interno delle cellule associato a liposomi, la cui fusione con la membrana plasmatica viene stimolata dalla secrezione di insulina in seguito a situazioni di iperglicemia per aumentare l’entrata di glucosio all’interno della cellula muscolare o adiposa.
• GLUT5 (intestino) permette l’assorbimento del glucosio e del fruttosio dal canale alimentare, anche se la maggior quantità di glucosio entra negli enterociti grazie al cotrasportatore simporto Na⁺/glucosio (trasporta il glucosio contro gradiente all’interno della cellula intestinale sfruttando il gradiente elettrochimico del sodio in modo che questo zucchero possa essere riversato in circolo grazie al trasportatore GLUT2).

N.B. La K_m è un parametro biochimico che indica l’affinità di una proteina con il suo substrato.

La glicolisi

Una volta che il glucosio è entrato all’interno della cellula, è fosforilato a glucosio-6-fosfato dall’enzima esochinasi (reazione di esterificazione del fosfato in posizione 6) in modo da facilitare l’accumulo del metabolita. In seguito, ad opera dell’enzima fosfogluco-isomerasi, è convertito a fruttosio-6-fosfato che viene fosforilato dalla fosfofruttochinasi 1 in fruttosio-1,6-bisfosfato, il quale viene scisso in due trioso fosfati dall’enzima aldolasi: la gliceraldeide-3-fosfato e il diidrossiacetone fosfato (le due forme sono interconvertibili ad opera dell’enzima trioso fosfato isomerasi).

Poi, la gliceraldeide-3-fosfato diventa substrato dell’enzima gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi che permette l’ossidazione con concomitante fosforilazione del substrato per formare NADH e 1,3-bisfosfoglicerato, il quale viene defosforilato dall’enzima fosfoglicerato chinasi a 3-fosfoglicerato per formare una molecola di ATP. Questo metabolita subisce un’isomerizzazione da parte dell’enzima fosfoglicerato mutasi per formare 2-fosfoglicerato, il quale viene trasformato in fosfoenolpiruvato dall’enzima enolasi ed infine, mediante la formazione di ATP, in piruvato dalla piruvato chinasi.

La glicolisi presenta una fase iniziale preparativa di investimento di energia in cui si ha l’utilizzo di 2 molecole di ATP ed una fase ossidativa di guadagno in quanto si ha il rilascio di 2 molecole di ATP per ogni trioso fosfato ossidato (uno a livello della fosfoglicerato chinasi e uno della piruvato chinasi), ma siccome si producono due molecole di trioso fosfato dal glucosio avremo la produzione di 4 molecole di ATP con una conseguente resa finale di 2 ATP e 2 NADH.

Glucosio + 2 ADP + 2 P_i + 2 NAD⁺ → 2 CH₃-CO-COOH + 2 ATP + 2 NADH + 2 H⁺

Alcune reazioni glicolitiche come quella dell’esochinasi, della fosfofruttochinasi 1 e della piruvato chinasi sono irreversibili in modo da permettere un controllo della via catabolica.

N.B. Se il NADH formato dalla glicolisi non venisse eliminato dal citosol si determinerebbe una bassa produzione di energia con la reversione della reazione portata avanti dall’enzima gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi bloccando il processo catabolico e provocando un malfunzionamento della cellula.

N.B. La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi è un enzima reversibile che permette l’ossidazione del substrato per fornire un NADH per ogni trioso fosfato e di introdurre un secondo gruppo fosfato nella molecola senza consumare ATP in quanto l’enzima contiene nel suo sito attivo una cisteina (Cys 149) e un’istidina (His 176), in particolare la cisteina lega con il suo gruppo sulfidrilico (SH) il gruppo carbonilico della gliceraldeide-3-fosfato formando un emiacetale che viene ossidato in un intermedio tioestere ad alto contenuto energetico per la perdita di un idruro che converte il NAD⁺ in NADH. A questo punto, il NADH perde affinità per il suo sito e viene sostituito da NAD⁺ in modo che, grazie alla rottura del legame tioestere, possa avvenire la fosforilazione del substrato e la formazione dell’acido 1,3-bisfosfoglicerico.

Questa reazione è molto importante perché l’enzima gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi può essere inibito da basse concentrazioni di iodoacetato, iodoacetamide, sali di mercurio ed arseniato (AsO₄^3-) in quanto agiscono effettuando un legame covalente con lo zolfo del sito attivo oppure il 3-bromopiruvato è un farmaco chemioterapico in fase di trial clinico perché in molti tumori la via glicolitica è privilegiata.

Se la reazione non avvenisse a livello del sito attivo dell’enzima gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, dall’ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato si formerebbero acido glicerico e idrogeno fosfato (HPO₄^2-) e per la formazione del prodotto finale sarebbe necessario fornire molta energia sia per indurne l’attivazione che per la reazione di fosforilazione; quindi l’enzima permette un vantaggio dal punto di vista cinetico e termodinamico.

Shuttle del NADH

Il NADH viene eliminato dal citosol mediante il trasferimento all’interno del mitocondrio non con un trasportatore (i pool di NAD⁺/NADH citosolici e mitocondriali sono distinti), ma grazie a:

• Shuttle del glicerolo-3-fosfato (si verifica soprattutto nel cervello e nel muscolo scheletrico in cui si richiede energia in tempi brevi) che avviene con una sola reazione di riduzione del diidrossiacetone fosfato a glicerolo-3-fosfato mediata dall’enzima glicerolo-3-fosfato deidrogenasi citosolico; il glicerolo-3-fosfato è in grado di attraversare la membrana esterna del mitocondrio dove diventa substrato dell’isoforma mitocondriale della glicerolo-3-fosfato deidrogenasi che ne permette l’ossidazione a diidrossiacetone fosfato con passaggio degli elettroni al FAD del complesso II della catena respiratoria (in questo processo viene persa una parte dell’energia potenziale del NADH).
• Shuttle del malato-aspartato (si verifica soprattutto nel fegato, nel rene e nel cuore dove non vi è necessità di energia in tempi brevi) in cui il potenziale riducente viene utilizzato per ridurre l’ossalacetato in malato mediante l’enzima malato deidrogenasi citosolico in modo che il malato possa passare dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale mediante il trasportatore antiporto malato/α-chetoglutarato; nella matrice mitocondriale, il malato viene riossidato a ossalacetato con liberazione di NADH mediante l’isoforma mitocondriale della malato deidrogenasi e poi viene transaminato ad aspartato in modo che possa uscire dalla matrice mediante il trasportatore antiporto glutammato-aspartato. Infine, nello spazio intermembrana, l’aspartato verrà nuovamente transaminato a ossalacetato per permettere la continuazione dello shuttle.

Attraverso la via glicolitica che avviene in tutte le cellule a livello del citosol, si verifica la formazione di piruvato, il quale viene ossidato mediante il processo della respirazione aerobica che avviene nei mitocondri a CO₂ e H₂O rilasciando la maggior parte dell’energia necessaria alla catena della fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP. Se il mitocondrio non è in grado di introdurre piruvato oppure non è capace di gestirlo o ossidarlo, affinché non sia bloccata la via glicolitica a causa dell’aumento del rapporto NADH/NAD⁺ (blocco della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi), il piruvato è ridotto a lattato attraverso l’azione dell’enzima lattato deidrogenasi in un processo detto fermentazione lattica, in particolare il carbonio in posizione 2 del piruvato è ridotto grazie all’utilizzo di NADH in modo che il lattato possa essere allontanato dalla cellula per la presenza in membrana di trasportatori per gli acidi monocarbossilici che funzionano secondo gradiente per estruderlo nel circolo ematico.

La reazione globale è:

Glucosio + 2 ADP + 2 Pi → 2 Lattato + 2 ATP

N.B. L’aumento della latticemia, cioè della concentrazione di lattato nel sangue, è un indice di malfunzionamento mitocondriale (a meno che non si verifichi subito dopo un esercizio di attività fisica intensa in quanto parte del piruvato è ridotto a lattato dal muscolo scheletrico).

L’enzima lattato deidrogenasi è una proteina tetramerica presente nell’organismo in 5 diverse isoforme per la combinazione delle subunità H (heart) e M (muscle), in particolare:

• Isoforma LDH 1 o HHHH è presente nel miocardio e negli eritrociti.
• Isoforma LDH 2 o HHHM è presente nel miocardio, nei globuli rossi, nel pancreas, nella corteccia renale, nel polmone e nel muscolo scheletrico.
• Isoforma LDH 3 o HHMM è presente nel polmone, nella placenta, nel muscolo scheletrico e nel pancreas.
• Isoforma LDH 4 o HMMM è presente nella midollare renale, nel muscolo scheletrico, nel polmone e nella placenta.
• Isoforma LDH 5 o MMMM è presente nel fegato e nel muscolo scheletrico.

La concentrazione di questo enzima nel sangue ha un significato diagnostico in quanto aumenta nelle miopatie gravi come ad esempio l’infarto, la distrofia muscolare (soprattutto nei bambini) e le malattie mitocondriali (in questo caso ha un maggiore significato diagnostico l’aumento della concentrazione di lattato); il suo valore è tanto maggiore quanto maggiore è il danno cellulare.

NAD⁺ + Lattato ⇔ NADH + Piruvato

La costante di equilibrio deve essere mantenuta costante nello stato stazionario, quindi, in caso di un aumento della concentrazione di piruvato e NADH, la reazione si sposta verso la produzione di lattato e NAD⁺.

N.B. Il rapporto NAD⁺/NADH citosolico ha un valore di circa 360, mentre quello della matrice mitocondriale ha un valore di 10-30.