Biochimica e Patologia clinica - Appunti

Radicali liberi

Si definisce radicale libero una specie molecolare contenente uno o più elettroni spaiati. La presenza di uno o più elettroni spaiati conferisce a tali specie molecolari (atomi o molecole) un’alta reattività. Per sapere se una specie chimica dà radicali liberi, bisogna conoscerne la configurazione elettronica.

H = 1 s¹

L’idrogeno ha un elettrone spaiato nell’orbitale s ed è pertanto un radicale libero.

O (Ossigeno singoletto - 16e) = 1 s², 2 s², 2 p⁶, 3 p⁴

Gli orbitali atomici, interagendo tra loro durante la formazione della molecola, generano un ugual numero di orbitali molecolari. Gli orbitali molecolari si distinguono in:

• Orbitali molecolari leganti, se i due elettroni che entrano in compartecipazione soggiornano più a lungo nella parte centrale della molecola.
• Orbitali molecolari anti-leganti, se i due elettroni soggiornano più a lungo nella regione opposta (esternamente).

Gli orbitali molecolari leganti si distinguono a loro volta in:

• σ, quando la sovrapposizione dei due orbitali avviene lungo lo stesso asse
• π, quando la sovrapposizione dei due orbitali avviene su assi paralleli

Gli orbitali molecolari anti-leganti si distinguono in:

• σ*
• π*

Per cui due orbitali s (uno per ogni atomo) generano un orbitale legante σ s ed un orbitale anti-legante σ*s. Così come sei orbitali p (tre per ogni atomo) generano sei orbitali molecolari: due orbitali σ x (uno legante ed uno anti-legante), due orbitali π y (uno legante ed uno anti-legante) e due orbitali π z (uno legante ed uno anti-legante).

L’O si qualifica come radicale libero perché possiede due elettroni spaiati, ognuno localizzato su un diverso orbitale π* anti-legante.

Specie reattive dell'ossigeno

Esistono due vie per l’attivazione dell’O₂ molecolare, cioè due vie per la formazione dei ROS:

1. Mediante elettroni (riduzione)

L’O₂ può andare incontro a due tipi di riduzione:

• Riduzione completa o tetravalente = O + 4e^- + 4H⁺ → 2H₂O. Questa reazione si verifica durante la fosforilazione ossidativa ed è catalizzata del complesso IV, detto anche Citocromo C Ossidasi, facente parte della catena di trasporto degli elettroni e inserito nella membrana mitocondriale interna.
• Riduzione parziale dell’ossigeno può verificarsi come:
  • Riduzione univalente = O₂ + e^- → O₂^- (anione superossido, è uno ione ed un radicale libero)
  • Riduzione bivalente = O₂^- + e^- + 2H⁺ → H₂O₂ (perossido di idrogeno)
  • Riduzione trivalente di Haber-Weiss = O₂^- + H₂O₂ → O₂ + OH^- + OH^† (OH^- è l’anione ossidrile, è carico negativamente ma non è un radicale; OH è il radicale idrossile, non è uno ione ma è un radicale libero)

Il radicale idrossile si può formare anche attraverso:

• La fissazione emolitica dell’H₂O₂ per effetto dell’irradiazione = H₂O₂ → 2OH
• La reazione di Fenton = Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH^- + OH

2. Mediante energia

O₂ + 22 kcal → O₂^† (ossigeno singoletto)

O₂ + 37 kcal → O₂⁺⁺ (ossigeno singoletto²)

I globuli rossi trasportano l’ossigeno grazie al legame tra l’O₂ ed il ferro contenuto nell’eme. L’interazione Fe²⁺ - O₂ non comporta nella maggior parte dei casi alcuna ossidoriduzione. La struttura molecolare dell’Hb, infatti, impedisce l’ossidazione del ferro da parte dell’ossigeno. Solo una piccola parte di Fe²⁺ viene ossidata a Fe³⁺ dall’O₂ che diventa O₂^-.

Hb ossigenata = ossiemoglobina

Hb deossigenata = desossiemoglobina

Hb ridotta (di colore bluastro)

Hb ossidata = metaemoglobina, Hb contenente Fe³⁺, di colore marroncino

La metaemoglobina può essere riconvertita in emoglobina dall’enzima METAEMOGLOBINAREDUTTASI. Questo enzima ha bisogno di una specie che si comporti da donatore di elettroni (NADH o FADH₂).

Oltre che durante la catena di trasporto degli elettroni e all’interno dei globuli rossi i ROS possono formarsi in seguito all’azione dell’enzima XANTINO OSSIDASI, all’autossidazione di catecolammine ed emoproteine e dalla reazione di Fenton.

Il radicale idrossile e i suoi effetti

Il radicale idrossile è il radicale libero più reattivo in quanto è in grado di reagire con un’ampia gamma di costituenti cellulari:

a. Lipidi di membrana

L’attacco dei lipidi di membrana da parte del radicale idrossile determina l’innesco di una reazione a catena nota come lipoperossidazione. Essa si verifica quando i radicali liberi, ed in particolare il radicale idrossile, vengono generati in prossimità di acidi grassi polinsaturi (AGP), come l’Acido Arachidonico e l’Acido Linolenico, costituenti la membrana cellulare. Vengono attaccati gli AGP perché più instabili rispetto agli acidi grassi saturi.

Si distinguono tre fasi:

• Iniziazione. Sottrazione di un H⁺ da parte del radicale idrossile a livello del locus minoris resistentiae del diene che è rappresentato dal carbonio tra due doppi legami. La fase di iniziazione determina la formazione di un radicale lipidico.
• Propagazione. Il radicale lipidico può seguire due vie: estrarre l’H⁺ dall’acido grasso adiacente determinando la formazione di un altro radicale lipidico (reazione a catena), oppure combinarsi con l’O₂ molecolare formando il radicale perossilico. Il radicale perossilico a sua volta estrae l’H⁺ ad un acido grasso vicino trasformandosi in lipide idroperossido.
• Estinzione. Il lipide idroperossido, essendo instabile, si rompe determinando la formazione di malonaldeide, reazione favorita dalla presenza di ioni metallici quali rame o ferro.

Il risultato netto finale dell’azione di una specie radicalica molto reattiva, come il radicale idrossile, sulla membrana è la conversione di acidi grassi polinsaturi in lipidi idroperossidi. Da un lato, questi tendono a spostarsi all’interno della membrana, determinandone la disorganizzazione: alterano la permeabilità della membrana, danneggiano le proteine transmembrana (recettori ed enzimi); dall’altro lato i lipidi idroperossidi, in presenza di rame e ferro, si decompongono formando malonaldeide, un’aldeide tossica, a sua volta in grado di indurre modificazioni chimiche sulle proteine e sul DNA.

b. Danno proteotossico

Il radicale idrossile è in grado, così come la malonaldeide, di ossidare i residui amminoacidici e formare Basi di Schiff.

c. Danno genotossico

Le lesioni causate dai ROS, ed in particolare dal radicale idrossile, nei confronti degli acidi nucleici possono essere o di rottura delle estremità della catena o di modificazione delle basi azotate, ad es. la formazione di 8 – idrossiguanina.

Ruolo fisiologico svolto dai radicali liberi

1. Difesa contro i microrganismi

La produzione dei radicali liberi rappresenta uno dei meccanismi di difesa delle cellule nei confronti dei microrganismi. L’uccisione dei microbi fagocitati può avvenire mediante due meccanismi:

• Attraverso la fusione dei fagosomi con i lisosomi, determinando la formazione dei fagolisosomi e quindi il contatto dei microbi fagocitati con gli enzimi lisosomiali.
• L’attivazione dell’OSSIDASI FAGOCITICA e dell’iNOS (Ossido Nitrico Sintasi Inducibile). L’ossidasi fagocitica è un complesso enzimatico che riduce parzialmente l’O₂, determinando la formazione di anione superossido (riduzione univalente). L’anione superossido, a sua volta, determina la formazione di perossido di idrogeno e quindi di radicale idrossile. L’ossidasi utilizza come cofattore il NADPH che si comporta da agente riducente. Il processo che porta alla formazione dei ROS è chiamato Burst Respiratorio. L’iNOS viene definita inducibile perché, a differenza della NOS endoteliale e neuronale che sono presenti costitutivamente nelle cellule endoteliali ed in quelle nervose, l’iNOS è assente nel citosol dei macrofagi quiescenti ma compare in seguito all’interazione di LPS e IFN-γ con specifici recettori di membrana. L’iNOS catalizza la conversione dell’Arginina in Citrullina con conseguente formazione di Ossido Nitrico diffusibile (NO). L’NO penetra all’interno dei fagolisosomi e combinandosi con i ROS genera RADICALE PEROSSINITRITO, altamente reattivo, che contribuisce insieme ai ROS e agli enzimi lisosomiali ad uccidere i microbi fagocitati. L’importanza dell’ossidasi fagocitica, e quindi della produzione dei ROS nell’ambito della difesa immunitaria, è dimostrata da una sindrome chiamata Malattia Granulomatosa Cronica. Tale patologia è causata da un deficit congenito dell’ossidasi fagocitica e si manifesta con l’incapacità di combattere le infezioni con i meccanismi dell’immunità innata (fagocitosi). Gli individui che ne sono affetti devono ricorrere ai meccanismi dell’immunità specifica - e in particolare dell’immunità cellulo-mediata – per eliminare o neutralizzare l’agente responsabile dell’infezione. Si formano, così, cospicui agglomerati di linfociti T e macrofagi chiamati granulomi.

2. Metabolismo degli eicosanoidi

I radicali liberi svolgono un ruolo centrale anche nel metabolismo degli eicosanoidi. Nella formazione delle prostaglandine a partire dall’AA è necessaria la presenza di lipidi idroperossidi che reagiscano col Fe³⁺ contenuto nel gruppo eme del sito catalitico dell’enzima CICLOSSIGENASI, che converte l’AA in PGG₂. Un eccesso di lipidi idroperossidi, però, può bloccare l’attività della ciclossigenasi.

3. Modulazione del tono vasale

I radicali liberi svolgono un ruolo centrale anche nella modulazione del tono vasale. Le cellule endoteliali producono continuamente anione superossido e NO: se predomina l’NO si ha vasocostrizione; se predomina l’anione superossido, l’NO viene inattivato e prevale la vasocostrizione.

Meccanismi protettivi contro la potenziale tossicità dei radicali liberi

1. Enzimi

• Eme-ossigenasi = Produce Bilirubina e CO dall’Eme. La bilirubina neutralizza i radicali liberi nel plasma, essendo una sostanza antiossidante. Il CO si lega all’eme della NOS bloccando la produzione di NO (stress nitrosativo).
• Superossido dismutasi (SOD) = Neutralizza l’anione superossido, determinando la formazione di O₂ e H₂O (O₂^- + O₂^- + 2 H⁺ → O₂ + H₂O). Esistono due forme di SOD: una citoplasmatica (rame/zinco-SOD) ed una mitocondriale (magnese-SOD). L’importanza della SOD è dimostrata dalla patogenesi della SLA, malattia causata da una mutazione a livello del gene che codifica per la SOD. Determina degenerazione dei motoneuroni centrali e periferici e conseguente atrofia muscolare neurogena. Strettamente connessa all’attività della SOD è l’azione catalitica dell’enzima catalasi.
• Catalasi = Neutralizza il perossido di idrogeno prodotto dalla reazione di dismutazione della SOD (2 H₂O₂ → O₂ + 2 H₂O). Anche questa è una reazione di dismutazione (un perossido di idrogeno si ossida ad ossigeno, mentre l’altro si riduce formando due molecole di acqua).
• Glutatione perossidasi = È una metallo-proteina contenente Selenio, anch’essa coinvolta nella neutralizzazione del perossido di idrogeno (H₂O₂ + 2 GSH → GSSG + 2 H₂O). Le due molecole di glutatione si ossidano per ridurre il perossido di idrogeno ad acqua. Il Glutatione è un tripeptide che viene assemblato da altri enzimi e non secondo la canonica sintesi proteica (mRNA Ribosomi). I tre amminoacidi che compongono il Glutatione sono Glutammato, Cisteina e Glicina. Connessa all’attività della glutatione perossidasi è l’azione della glutatione reduttasi.
• Glutatione reduttasi = Riduce il glutatione ossidato dalla glutatione perossidasi (GSSG + NADPH + H⁺ → 2 GSH + NADP⁺). Il NADPH proviene dalla via del pentosio fosfato.

2. Sostanze antiossidanti

• Tocoferoli (vitamine E: α-, β-, γ-, δ-tocoferolo) = Il più potente antiossidante tra i tocoferoli è l’α-tocoferolo. È contenuto nelle membrane cellulari e nelle lipoproteine plasmatiche. È in grado di interrompere la reazione a catena della lipoperossidazione. Il gruppo ossidrilico legato alla struttura idrofilica dell’α-tocoferolo è in grado di cedere l’H⁺ ai radicali perossilici che si formano durante la fase di propagazione della lipoperossidazione. I radicali perossilici, piuttosto che estrarre l’H⁺ da un acido grasso insaturo adiacente e convertirsi in lipidi idroperossidi, estraggono un H⁺ dall’α-tocoferolo che viene convertito in un nuovo radicale, detto α-tocoferossile, che però è poco reattivo e non attacca gli acidi grassi vicini. Il radicale α-tocoferossile viene ridotto ad α-tocoferolo per azione dell’Acido Ascorbico che viene convertito in Acido Deidroascorbico. Questo a sua volta viene nuovamente ridotto ad Acido Ascorbico dal NADH che si ossida.
• Caroteni = Rimuovono i radicali liberi appena formati.
• Acido ascorbico ridotto (vitamina C) o ossidato (acido deidroascorbico) = Si comporta da agente riducente ossidandosi e riducendo l’α-tocoferossile ad α-tocoferolo. È dunque coinvolto nella rigenerazione della vitamina E.
• Glutatione = Si comporta da agente riducente, contribuendo alla riduzione dell’H₂O₂. Tale reazione è catalizzata dalla Glutatione Perossidasi. Lo stato ridotto del Glutatione è mantenuto dalla Glutatione Reduttasi intracellulare.
• Acido urico e bilirubina = Eliminano i radicali liberi nel plasma.
• Polifenoli (flavonoidi, curcumino, resveratrolo, ecc.) = I flavonoidi rappresentano il gruppo più importante di polifenoli. La loro struttura è costituita da due anelli aromatici legati da un anello eterociclico. L’azione antiossidante è dovuta a gruppi idrossilici degli anelli aromatici. I flavonoidi hanno anche un’azione antiapoptotica, inibendo l’ingresso di ioni calcio nelle cellule.
• Licopene = Presente nel pomodoro. Se cotto, si trasforma in acido ferrulico, antiossidante.

I meccanismi antiossidanti, oltre che in enzimi citoprotettivi e sostanze antiossidanti, possono essere suddivisi in base al meccanismo di azione in:

• Antiossidanti primari (chelanti del ferro, SOD, GPX, Catalasi). Interferiscono con l’inizio della catena, riducendo il tasso di formazione dei radicali liberi.
• Antiossidanti secondari (Chain Breaking Antiossidanti: fenoli, vitamine E). Interferiscono con la fase di propagazione.

Ruolo dei radicali liberi in patologia umana

1. Emocromatosi ed emosiderosi

In condizioni normali il ferro viene sequestrato in modo efficace per opera di diverse proteine, come la transferrina e la ferritina, per evitare la sua partecipazione alla reazione di Fenton e quindi la genesi di radicali idrossilici. Nell’emocromatosi e nell’emosiderosi si verifica un accumulo patologico di ferro a livello dello strato basale dell’epidermide (iperpigmentazione cutanea), a livello del fegato (fibrosi) e del pancreas (diabete bronzino). Dal punto di vista clinico le due patologie sono identiche. Differiscono, però, dal punto di vista eziologico: l’emocromatosi è causata da un’alterazione congenita del metabolismo del ferro, con aumentato assorbimento di ferro; l’emosiderosi, invece, è acquisita. In essa l’eccesso di ferro può derivare da iperemolisi, eccessiva somministrazione cronica di ferro per via parentelare, emotrasfusioni. In entrambe le condizioni gli epatociti vanno incontro ad un progressivo sovraccarico di ferro che si deposita sotto forma di ferritina nel citosol e di emosiderina nei lisosomi. È probabile che una parte di questo ferro possa non essere sequestrata e permanere nella forma libera. Il ferro libero può contribuire alla formazione del radicale idrossile e quindi alla lipoperossidazione delle membrane degli organuli subcellulari, in particolare dei mitocondri e dei lisosomi. Il conseguente rilascio di idrolasi acide è responsabile di un grave danno cellulare e quindi della fibrosi epatica. Recentemente è stato dimostrato che la perossidazione indotta dal ferro provoca un aumento della trascrizione del gene del collagene, indicando che essa possa svolgere un ruolo importante anche nello sviluppo della cirrosi epatica, durante la quale si verifica la progressiva sostituzione del parenchima epatico con tessuto connettivo.

2. Carcinogenesi

L’attacco dei radicali liberi nei confronti del DNA può determinare danno genotossico (modificazione delle catene e delle basi azotate) che a sua volta può determinare errori di trascrizione e/o di replicazione.

3. Danno da riperfusione

I radicali liberi possono essere generati durante la riperfusione di un tessuto ischemizzato. La conoscenza del danno cellulare da riperfusione assume un’importanza fondamentale soprattutto nell’ambito dei trapianti d’organo. Il danno da riperfusione è determinato da due eventi che si verificano nel tessuto ischemico:

• Diminuzione di ATP e sua progressiva trasformazione in AMP secondo la reazione ADP + ADP → AMP + ATP. L’AMP a sua volta si converte in Adenosina Inosina Ipoxantina.
• Attivazione di una proteasi calcio-dipendente (calpaina) che converte la xantino deidrogenasi in XANTINO OSSIDASI. Tale attivazione dipende dall’aumento della concentrazione di Ca²⁺ intracellulare conseguente alla diminuzione della produzione di ATP necessario per il mantenimento del gradiente di concentrazione del calcio, più abbondante all’esterno della cellula. La xantino deidrogenasi utilizza il NAD⁺ come accettore di elettroni che si comporta quindi da agente ossidante. La xantino ossidasi, invece, utilizza direttamente l’O₂, la cui riduzione parziale determina la formazione dei ROS.