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ACIDO URICO e BILIRUBINA = Eliminano i radicali liberi nel plasma.

POLIFENOLI (flavonoidi, curcumino, resveratrolo, ecc.) = I flavonoidi rappresentano il gruppo

più importante di polifenoli. La loro struttura è costituita da due anelli aromatici legati da un

anello eterociclico. L’azione antiossidante è dovuta a gruppi idrossilici degli anelli aromatici. I

flavonoidi hanno anche un’azione antiapoptotica, inibendo l’ingresso di ioni calcio nelle cellule.

LICOPENE = Presente nel pomodoro. Se cotto, si trasforma in acido ferrulico, antiossidante.

I meccanismi antiossidanti, oltre che in enzimi citoprotettivi e sostanze antiossidanti, possono

essere suddivisi in base al meccanismo di azione in:

- Antiossidanti primari (chelanti del ferro, SOD, GPX, Catalasi). Interferiscono con l’inizio

della catena, riducendo il tasso di formazione dei radicali liberi;

- Antiossidanti secondari (Chain Breaking Antiossidanti: fenoli, vitamine E). Interferiscono

con la fase di propagazione.

RUOLO DEI RADICALI LIBERI IN PATOLOGIA UMANA

1. EMOCROMATOSI ED EMOSIDEROSI

In condizioni normali il ferro viene sequestrato in modo efficace per opera di diverse proteine,

come la transferrina e la ferritina, per evitare la sua partecipazione alla reazione di Fenton e

quindi la genesi di radicali idrossilici.

Nell’emocromatosi e nell’emosiderosi si verifica un accumulo patologico di ferro a livello dello

strato basale dell’epidermide (iperpigmentazione cutanea), a livello del fegato (fibrosi) e del

pancreas (diabete bronzino).

Dal punto di vista clinico le due patologie sono identiche. Differiscono, però, dal punto di vista

eziologico: l’emocromatosi è causata da un’alterazione congenita del metabolismo del ferro,

con aumentato assorbimento di ferro; l’emosiderosi è, invece, acquisita. In essa l’eccesso di

ferro può derivare da iperemolisi, eccessiva somministrazione cronica di ferro per via

parentelare, emotrasfusioni.

In entrambe le condizione gli epatociti vanno incontro ad un progressivo sovraccarico di ferro

che si deposita sottoforma di ferritina nel citosol e di emosiderina nei lisosomi. E’ probabile che

una parte di questo ferro possa non essere sequestrata e permanere nella forma libera. Il ferro

liberò può contribuire alla formazione del radicale idrossile e quindi alla lipoperossidazione delle

membrane degli organuli subcellulari, in particolare dei mitocondri e dei lisosomi. Il

conseguente rilascio di idrolasi acide è responsabile di un grave danno cellulare e quindi della

fibrosi epatica.

Recentemente è stato dimostrato che la perossidazione indotta dal ferro provoca un aumento

della trascrizione del gene del collagene, indicando che essa possa svolgere un ruolo

importante anche nello sviluppo della cirrosi epatica, durante la quale si verifica la progressiva

sostituzione del parenchima epatico con tessuto connettivo.

2. CARCINOGENESI

L’attacco dei radicali liberi nei confronti del DNA può determinare danno genotossico

(modificazione delle catene e delle basi azotate) che a sua volta può determinare errori di

trascrizione e/o di replicazione.

3. DANNO DA RIPERFUSIONE

I radicali liberi possono essere generati durante la riperfusione di un tessuto ischemizzato. La

conoscenza del danno cellulare da riperfusione assume un’importanza fondamentale

soprattutto nell’ambito dei trapianti d’organo.

Il danno da riperfusione è determinato da due eventi che si verificano nel tessuto ischemico:

- diminuzione di ATP e sua progressiva trasformazione in AMP secondo la reazione ADP +

ADP AMP + ATP. L’AMP a sua volta si converte in Adenosina Inosina Ipoxantina;

  

- attivazione di una proteasi calcio-dipendente (calpaina) che converte la xantino

deidrogenasi in XANTINO OSSIDASI. Tale attivazione dipende dall’aumento della

concentrazione di Ca2+ intracellulare conseguente alla diminuzione della produzione di

ATP necessario per il mantenimento del gradiente di concentrazione del calcio, più

abbondante all’esterno della cellula. La xantino deidrogenasi utilizza il NAD+ come

accettore di elettroni che si comporta quindi da agente ossidante. La xantino ossidasi,

invece, utilizza direttamente l’O , la cui riduzione parziale determina la formazione dei

2

ROS.

Finché il tessuto resta ischemico la xantino ossidasi non può funzionare. Quando, però, si

ripristina il flusso e le cellule tornano a disporre di O , la xantino ossidasi trasforma l’ipoxantina

2

in acido urico, formando contemporaneamente anione superossido. Dalla dismutazione

dell’anione superossido ad opera della SOD origina perossido di idrogeno, da cui – in presenza

di Fe2+ - può formarsi radicale idrossile per la rezione di Fenton.

4. LESIONE FLOGISTICA

Neutrofili e macrofagi attivati possono danneggiare i tessuti normali liberando all’esterno

reattivi dell’ossigeno, enzimi lisosomiali e NO. La forma più estrema di danno tissutale mediato

dai neutrofili in risposta ai microrganismi è la formazione di acessi.

5. ATEROSCLEROSI

La patogenesi dell’aterosclerosi è ancora poco chiara, ma sicuramente i radicali liberi giocano

un ruolo fondamentale nella sua estrinsecazione.

Ad innescare il processo patogenetico è probabilmente una lesione dell’endotelio vascolare

causata dai lipoperossidi presenti nelle lipoproteine plasmatiche LDL. Tale lesione

richiamerebbe i macrofagi che, una volta attivati, possono danneggiare le cellule endoteliali

vicine mediante secrezione di anione superossido, perossido di idrogeno ed enzimi lisosomiali.

Inoltre i macrofagi possiedono recettori per le ox-LDL (recettori scavenger) tramite i quali

inglobano le lipoproteine trasformandosi in cellule schiumose, caratteristiche delle lesioni

ateromatose.

6. DIABETE

Nell’ambito del diabete mellito di tipo I e II, la produzione di radicali liberi in misura superiore

rispetto alle capacità neutralizzanti delle difese antiossidanti (stress ossidativi) connessa con

l’iperglicemia è probabilmente responsabile delle complicazioni a lungo termine della sindrome

diabetica. Tali complicazioni sono rappresentati dalla vasculopatia (micro- e macroangiopatia),

dalla retinopatia, dalla nefropatia e dalla neuropatia. L’iperglicemia da un lato determina un

aumento della produzione di radicali liberi, a causa dell’autossidazione del glucosio, e dall’altro

una diminuzione delle difese antiossidanti cellulari.

7. MALATTIE NEUROLOGICHE

Il ruolo dello stress ossidativo nella fisiopatologia del sistema nervoso è di particolare

importanza in quanto il cervello, essendo un organo ad alto consumo di ossigeno, con un

elevato contenuto di ferro (presente nelle MAO, responsabili della degradazione dei

neurotrasmettitori) e con una relativamente scarsa efficienza delle difese antiossidanti,

vitamina E, GSH (il neurone capta dall’esterno il GSH prodotto dagli astrociti – Ciclo di Meister

– vedi oltre), risulta particolarmente suscettibile al danno da radicali liberi.

In condizioni normali vi è equilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti. La rottura di questo

equilibrio con prevalenza dei meccanismi pro-ossidanti rappresenta il cosiddetto stress

ossidativo. La fonte principale di radicali liberi è rappresentata dai mitocondri. I neuroni

possiedono un alto metabolismo ossidativo. Si calcola che circa il 2% dell’ossigeno consumato

dal cervello si converta in anione superossido. Per cui, quando il tasso di generazione dei

radicali liberi eccede la capacità detossificante delle difese antiossidanti si instaura una

condizione di stress ossidativo. La molecola dell’ossigeno rappresenta un paradosso biologico:

se da un lato è indispensabile per la vita perché contribuisce in maniera determinante

all’ossidazione delle molecole organiche e alla produzione di energia, dall’altro la sua riduzione

parziale contribuisce alla genesi di radicali liberi che rappresentano un rischio per l’integrità

strutturale e funzionale di molecole importanti come DNA, proteine e lipidi.

All’equilibrio redox del SNC partecipa attivamente il sistema dell’NO-sintasi. Nel SNC ne sono

espressi tutti e tre gli isoenzimi:

- nNOS espressa dai neuroni;

- eNOS espressa dalle cellule endoteliali;

- iNOS espressa dagli astrociti e dai macrofagi.

L’NO ha diverse funzioni:

- a livello vasale è un potente vasodilatatore;

- a livello del SNC, ed in particolare dell’ippocampo, contribuisce ai processi di

memorizzazione intervenendo sulla plasticità sinaptica. L’interazione del glutammato

con il recettore-canale NMDA presente sulla membrana dell’elemento post-sinaptico

consente il passaggio degli ioni Ca2+ dalla fessura sinaptica al citosol del neurone post-

sinaptico. Il calcio stimola l’attività dell’iNOS modulando in maniera positiva la sintesi di

NO che si comporta da messaggero retrogrado in virtù della sua diffusibilità. L’NO,

infatti, diffonde al neurone presinaptico dove attiva la guanilato ciclasi. Il cGMP a livello

del neurone presinaptico favorisce il rilascio di glutammato nel vallo sinaptico,

determinando un potenziamente a lungo termine dell’attività del neurotrasmettitore;

- l’NO contribuisce anche ai meccanismi di difesa immunitaria con la sua attività

battericida.

Se, però, l’NO è prodotto in eccesso, inibisce il complesso IV della catena di trasporto. Ciò

determina una deplezione di ATP e un aumento della produzione di anione superossido. L’NO si

combina con l’anione superossido formando il potente ossidante ANIONE PEROSSINITRITO

(ONOO-) che, degradandosi, determina la formazione di radicale idrossile che provoca la morte

neuronale.

AGING DEL SNC

Il danno ossidativo protratto a carico di acidi nucleici, proteine e lipidi è ritenuto la causa più

importante delle modificazioni biochimiche e fisiopatologiche che si osservano durante

l’invecchiamento del SNC e durante i fenomeni neurodegenerativi (Alzheimer, Parkinson).

Evidenze sperimentali dimostrano il coinvolgimento dello stress ossidativo nell’estrinsecazione

dell’aging del SNC e delle neurodegenerazioni:

la quantità di molecole di DNA e proteine alterate ossidativamente aumenta con l’età;

- regimi alimentari come la restrizione calorica e l’assunzione di vitamina E riducono

- l’accumulo di markers del danno genotossico (8-idrossiguanina) e proteotossico (Basi di

Schiff);

- è stata riscontrata un’alterazione della funzione mitocondriale ed, in particolare, deficit

di attività del complesso I nel morbo di Parkinson, dei complessi II e III nella Corea di

Huntington, del complesso IV nell’Alzheimer e nell’invecchiamento. I mitocondri

rappresentano la principale fonte di radicali liberi. E’ ovvio, quindi, che una loro

disfunzione sia equivalente ad un danno da radicali liberi e all’instaurarsi dello stress

ossidativo. Inoltre…

il danno ossidativo a carico del DNA mitocondriale aumenta all’aumentare dell’età. In

- genere il DNA mitocondriale è vicino alla membrana mitocondriale interna dove avviene

la maggiore produzione di radicali liberi; non ci sono istoni associati al DNA

mitocondriale e l’attività catalitica della DNA polimerasi mitocondriale è meno precisa di

quella nucleare;

- la diminuzione dell’efficienza del complesso IV durante l’invecchiamento è dovuta alla

maggiore produzione di NO. Per cui un maggior numero di elettroni si trasferisce dal

coenzima Q all’O , piuttosto che al complesso IV, con formazione di anione superossido.

2

MORBO DI PARKINSON

E’ una patologia neurodegenerativa relativamente frequente (colpisce una persona su 40).

Il danno cerebrale si realizza a livello dei gangli della base ed è caratterizzato dalla perdita

specifica dei neuroni dopaminergici della Sostanza Nera e dalla presenza di caratteristiche

inclusioni proteiche nel citoplasma neuronale, denominate corpi di Lewis.

La sintomatologia è caratterizzata da tremori, instabilità posturale, ipocinesia (inespressività

del volto) ed ipertornia (rigidità), che insieme configurano la sindrome ipertonico-ipocinetica

caratteristica della patologia.

La patogenesi non è ancora pienamente conosciuta. Numerosi dati sperimentali, comunque,

sostengono l’ipotesi che lo stress ossidativo possa rappresentare un fattore chiave per lo

sviluppo della malattia. Studi post mortem hanno evidenziato un aumento nel contenuto di

lipidi idroperossidi di circa dieci volte superiori nei pazienti affetti da Parkinson rispetto ai

pazienti non-parkinsoniani. A livello della sostanza nera, inoltre, l’attività della glutatione

perossidasi e della catalasi è ridotta rispetto ad altre regioni cerebrali mentre l’attività della

SOD è aumentata. Ciò determina un accumulo di perossido di idrogeno che, in presenza di ioni

metallici (ferro e rame), si riduce generando radicale idrossile (reazione di Fenton).

A causa della traslocazione dell’ L-cisteina nelle cellule dopaminergiche si ha la condensazione

dell’L-cisteina con la dopamina che dà origina alle DEIDROSSIBENZOTIAZINE, composti tossici

che si comportano da potenti inibitori del complesso I. La disfunzione mitocondriale

conseguente determina un aumento della produzione di ROS.

La vitamina E, inoltre, ha dimostrato di esercitare un’azione protettiva nei confronti dei neuroni

della sostanza nera. La deprivazione di vitamina E provoca la perdita del 30% dei neuroni

dopaminergici della sostanza nera. Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato come

l’assunzione prolungata di α-tocoferolo riduca l’incidenza del Morbo di Parkinson.

MALATTIA DI ALZHEIMER

E’ una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce la memoria e le facoltà cognitive.

Tale malattia è caratterizzata dalla presenza di placche amiloidi diffuse e dalla degenerazione

neurofibrillare (grovigli neurofibrillari).

Le placche amiloidi si formano in seguito alla deposizione di β-amiloide, un peptide di 44

amminoacidi derivante dal clivaggio anomalo di un peptide molto più lungo. La deposizione di

β-amiloide è responsabile della formazione delle placche senili (fase preclinica). Si formano

probabilmente in alcune regioni dell’encefalo ed in particolare a livello dell’ippocampo

(memoria) e dell’amigdala (attenzione). La trasformazione delle placche senili in placche

diffuse (fase clinica) è conseguente a fenomeni degenerativi perifericamente alle placche senili.

In virtù della localizzazione delle placche senili (ippocampo e amigdala) l’esordio clinico di

questa malattia si identifica con un deficit più o meno grave della sfera cognitivo-mnemonica.

La tossicità della β-amiloide si estrinseca attraverso la produzione di radicali liberi. La β-

amiloide presente nelle placche è in grado di attivare le cellule della microglia con conseguente

rilascio di ossidanti, quali NO, derivanti dall’attivazione dell’iNOS (NO + O -ׂ ONOO-).

2

L’inibizione del complesso IV da parte della β-amiloide determina una aumento di elettroni che

vengono ceduti all’ O dal complesso Q piuttosto che al complesso IV inibito. Di conseguenza si

2

ha la riduzione parziale dell’ossigeno ad anione superossido.

Si ha accumulo di ferro nei neuroni che presentano anomalie del citoscheletro determinate

dagli accumuli intracellulari di materiale fibrillare (grovigli neurofibrillari) costituito da Filamenti

Elicoidali Appaiati (FEA), derivati da una proteina patologicamente iperfosforilata (proteina

TAU).

Le caratteristiche che accomunano la sostanza β-amiloide e la proteina TAU, che entrano

rispettivamente nella costituzione delle placche amiloidi e dei grovigli neurofibrillari, sono due:

insolubilità, che determina precipitazione e quindi accumulo;

-

- resistenza all’azione degli enzimi proteolitici, che determina irreversibilità della lesione.

La β-amiloide deriva dal precursore APP che è una proteina glicosilata di membrana costituita

da un dominio extracellulare N-terminale, un dominio citoplasmatico C-terminale e un dominio

transmembrana. Il peptide β/A4 (β-amiloide) è costituito da una porzione del dominio

transmembrana e un breve segmento adiacente del dominio extracellulare. E’ ovvio quindi che

il peptide β/A4 derivi da un’alterata proteolisi (clivaggio) dell’APP.

Le vie del metabolismo dell’APP sono due:

una via lisosomiale. Il clivaggio dell’APP è effettuato dagli enzimi lisosomiali;

- una via secretasica. La normale proteolisi delle proteine APP avviene ad opera

- dell’enzima α-secretasi.

Un’alterazione, quindi, di tali vie metaboliche, può determinare la formazione del peptide β/A4.

Evidenze sperimentali hanno dimostrato che in caso di Morbo di Alzheimer la funzione dei

lisosomi dei neuroni corticali è alterata e la proteolisi del peptide APP è catalizzata dalle β- e γ-

secretasi piuttosto che dall’α-.

Un’altra ipotesi patogenetica si basa sulla convinzione che un’aumentata sintesi di APP possa

essere alla base di un’eccessiva produzione di β/A4. Tale convinzione deriva da osservazioni

condotte su pazienti effetti da Trisomia 21. Questi pazienti hanno una copia extra del gene APP

e di conseguenza una maggiore incidenza ed una comparsa più precoce dell’Alzheimer.

Per quanto riguarda la proteina TAU, un’inappropriata o eccessiva fosforilazione la

trasformerebbe nella proteina A68 che entra nella costituzione dei filamenti elicoidali appaiati

e, di conseguenza, dei grovigli neurofibrillari.

La sintomatologia della malattia è rapportabile ad un deficit colinergico. Si ha, infatti, una

ridotta attività dell’enzima colina-acetiltrasferasi (CAT). La CAT catalizza la sintesi dell’ Ach da

acetil-coA e colina. La riduzione dell’attività della CAT (del 30% inferiore al normale) è

localizzata nella corteccia temporale, che rappresenta peraltro una delle sedi più colpite dalle

alterazioni neurologiche nel morbo di Alzheimer. Si ha, inoltre, un deficit di somatostatina,

si riduce la concentrazione di somatostatina intraneuronale.

La diagnosi di Malattia di Alzheimer è clinica. Non esiste, infatti, nessun test di conferma, a

parte la biopsia cerebrale che raramente trova una giustificazione etica (estremamente lesiva e

pericolosa). L’unico risultato significativo è stato il riscontro di una riduzione dei livelli liquorali

di somatostatina.

La terapia è volta a prevenire l’anomala fosforilazione della proteina TAU e quindi la formazione

della proteina A68 e la sua deposizione nei grovigli neurofibrillari; è volta, inoltre, a prevenire

la degradazione del peptide APP a livello lisosomiale. Ad esempio, le clorochine determinano un

aumento del PH all’interno dei lisosomi e quindi una diminuzione delle idrolasi acide lisosomiali.

DISCINESIA TARDIVA

E’ un disturbo del movimento conseguente alla somministrazione cronica di farmaci

neurolettici. L’incidenza di questo effetto collaterale è abbastanza alta ed è correlata con l’età

dei pazienti sottoposti a tale somministrazione e con il tempo di trattamento. La discinesia

tardiva colpisce il 20 % di soggetti dopo 4 anni di trattamento, il 40% dopo 8 anni. L’incidenza

della patologia aumenta del 60% nei pazienti oltre i 65 anni di età.

Il meccanismo patogenetico si basa sulla degenerazione dei neuroni del sistema dopaminergico

e di quello gabaergico. L’aumentata produzione di radicali liberi durante il trattamento con i

farmaci neurolettici porta alla degenerazione neuronale. Per questo si è pensato di utilizzare un

trattamento con antiossidanti per contrastare la sintomatologia della discinesia tardiva.

Numerosi studi clinici hanno dimostrato l’efficacia terapeutica della vitamina E nell’indurre un

miglioramento della sintomatologia associata alla malattia.

SINDROME NEUROLOGICA DA DEFICIENZA DI VITAMINA E

La sintomatologia di tale affezione è caratterizzata da:

atassia cerebellare;

- degenerazione nevrassiale a livello del tronco encefalico, del midollo spinale e dei nervi

- periferici (areflessia, diminuzione della sensibilità propriocettiva e vibratoria);

degenerazione della retina.

-

I disturbi regrediscono dopo la reintroduzione di tocoferoli nella dieta.

L’origine di questi disturbi sembra risiedere nell’aumento dello stress ossidativo dovuto alla

diminuzione della concentrazione della vitamina E.

Il cervelletto è la regione del SNC che presenta la più bassa concentrazione di α-tocoferolo e

che quindi risulta essere più sensibile alla carenza di vitamina E, donde l’atassia cerebellare

quale principale disturbo della sindrome.

La deficienza di vitamina E da malnutrizione è un evento piuttosto raro nel mondo

occidentale. In un lavoro condotto in India su bambini affetti da grave malnutrizione nell’80%

dei casi sono stati riportati segni neurodegenerativi caratteristici della sindrome da carenza di

vitamina E.

Di più comune riscontro clinico è la deficienza secondaria di vitamina E causata da

malassorbimento lipidico associato a sindrome dell’intestino corto, aβlipoproteinemia (le

lipoproteine veicolano nel sangue le vitamine liposolubili), sindromi epatobiliari con colestasi

cronica.

Una particolare forma di tale sindrome è la Sindrome da Deficienza Isolata di Vitamina E. La

sua eziologia è dovuta ad una mutazione del gene che codifica per la proteina deputata al

trasporto della vitamina E (α-tocoferolo Binding Protein). Tale proteina è indispensabile per

l’incorporazione delle vitamine nelle VLDL, mentre l’assorbimento intestinale e il trasporto al

fegato della vitamina E avviene con un meccanismo aspecifico e attraverso i chilomicroni. Il

successivo passaggio dal fegato richiede l’azione specifica dell’α-tocoferolo Binding Protein e

quindi l’incorporazione della vitamina E nelle VLDL.

Studi preliminari sembrano incoraggiare l’utilizzo della vitamina E in sindromi neurologiche

quali il Parkinson, l’Alzheimer, la Corea di Huntington, la Sclerosi Multipla, la SLA, per cui

sembra razionale ipotizzare lo sviluppo di protocolli clinici in cui l’impiego ad alte dosi di

vitamina E rappresenti il cardine di un approccio terapeutico mirato alla prevenzione e al

trattamento delle patologie neurodegenerative e dell’invecchiamento.

CICLO DI MEISTER

La sintesi del glutatione si estrinseca attraverso due vie metaboliche (pathways) separate, che

entrano nella costituzione di un ciclo definito come ciclo di Meister o ciclo del γ-glutamile.

La funzione di tale ciclo è quella di garantire la presenza di GSH all’interno dei neuroni. Infatti,

il GSH prodotto e rilasciato dagli astrociti non può essere direttamente captato dai neuroni,

non essendo in grado di attraversare la membrana cellulare. Entra nei neuroni grazie all’azione

della γ-glutamiltranspeptidasi. Il ciclo di Meister, quindi, serve alla produzione di GSH

all’interno dei neuroni.

La penetrazione del GSH all’interno delle cellule può realizzarsi solo previa coniugazione del

GSH (γ-glutamil-cisteinglicina) con un amminoacido extracellulare che si lega al γ-glutamile.

- Il primo enzima coinvolto nel trasporto del GSH attraverso la membrana cellulare è la

γ-GLUTAMIL-TRANSPEPTIDASI (GGT). Questo enzima scinde il GSH extracellulare a

livello del legame covalente tra il γ-glutamile e il dipeptide cisteinglicina.

- La cisteinglicina viene scissa in glicina e cisteina dalla DIPEPTIDASI. Il γ-glutamile

rimane legato all’amminoacido.

- Se questo amminoacido è la cisteina, il dipeptide γ-glutamilcisteina funge direttamente

da substrato insieme alla glicina (che deriva dal clivaggio della cisteinglicina ad opera

della dipeptidasi) dell’enzima GLUTATIONE SINTETASI, che appunto catalizza la

condensazione della glicina con il dipeptide γ-glutamilcisteina (consumo = 1 ATP).

- Se tale amminoacido non è la cisteina, il γ-glutamil-AA è metabolizzato in 5-oxoprolina

ad opera dell’enzima γ-GLUTAMIL-CICLOTRANSFERASI (reazione 1). La 5-oxoprolina a

sua volta viene convertita in glutammato a spese di 1 ATP (reazione 2). Il glutammato

si lega quindi alla cisteina derivata dal clivaggio della cisteinglicina. La formazione del

legame tra la cisteina ed il glutammato è catalizzata dall’enzima γ-GLUTAMILCISTEINA

SINTETASI (reazione 3) e richiede 1 ATP. La γ-glutamilcisteina si condensa poi con la

glicina determinando così la formazione del GSH a spese di 1 ATP. Anche questa

reazione è catalizzata dall’enzima GLUTATIONE SINTETASI.

Quindi la sintesi del GSH si estrinseca attraverso una serie di reazioni che richiedono in tutto 3

molecole di ATP se il γ-glutamile si lega ad un amminoacido diverso dalla cisteina, altrimenti

una sola molecola di ATP.

VITAGENI

In genere lo stress cellulare (termico/ossidativo/nitrosativo) induce la modulazione

dell’espressione genica.

Se lo stress è troppo intenso o troppo prolungato si ha un aumento dei geni che codificano per

proteine pro-apoptotiche; se lo stress è poco intenso e/o di breve durata aumenta

l’espressione di geni che codificano per proteine coinvolte nel mantenimento della

sopravvivenza cellulare (vitageni o geni da stress).

a. STRESS TERMICO

Induce la denaturazione di diverse proteine. Le proteine denaturate richiamano le HSP (Heat

Shock Proteins) in virtù della loro funzione di chaperon molecolari.

In condizioni fisiologiche le HSP sono legate a particolare fattori di trascrizione detti HSF (Heat

Shock Factors) che gli impediscono di esercitare la loro funzione.

Il distacco delle HSP dagli HSF rimuove l’inibizione ed induce l’attivazione degli HSF. Questi

traslocano nel nucleo e si legano a sequenze consenso presenti nei promotori dei vitageni dette

HSE (Heat Shock Elements). Viene così aumentata l’espressione dei vitageni che codificano per

le HSP.

b. STRESS OSSIDATIVO

I ROS attivano la via delle MAP chinasi che porta all’attivazione di fattori di trascrizione

attraverso i quali si ha l’attivazione di geni redox-sensibili (vitageni) che codificano per proteine

attive nell’antagonizzare le condizioni perossidanti, ristabilendo così l’omeostasi ossido-

riduttiva:

- SOD

- Glutatione Perossidasi

- Ferritina e metallotioneina (legano il ferro, impedendone l’entrata nella reazione di Fenton)

- HSP-70 (funzione antiapoptotica)

- Eme-Ossigenasi (HSP-32)

Tali fattori strascrizionali interagiscono con sequenze consenso presenti nei promotori dei

vitageni dette ARE (Antioxidant Responsive Elements).

c. STRESS NITROSATIVO

Deriva dall’eccessiva produzione di NO. La risposta allo stress nitrosativo è simile a quella dello

stress ossidativo: attivazione di fattori di trascrizione e conseguente produzione di proteine

quali SOD, HSP-70, emossigenasi.

La scoperta dei vitageni ha aperto le porte a nuove prospettive farmacologighe nell’ambito

della terapia contro quelle specifiche patologie in cui lo stress ossidativo gioca un ruolo centrale

nella loro estrinsecazione.

La conoscenza dei meccanismi che determinano l’induzione dei vitageni dipende dalla

diminuzione del rapporto GSH/GSSG: la deplezione del GSH rappresenta la conseguenza

diretta dello stress ossidativo.

NO-SYSTEM

La tossicità dell’NO è legata alla formazione di anione perossinitrito (ONOO-), a sua volta

dipendente dall’interazione dell’NO con l’anione superossido. Di conseguenza la cinetica della

reazione dell’NO con l’O2-ׂ dipende dall’attività della NOS (Ossido Nitrico Sintasi) e della SOD,

che neutralizza l’anione superossido. In seguito all’attivazione della NOS, causata dal legame

con LPS e citochine infiammatorie, viene prodotto NO in quantità eccessiva. L’NO inibisce il

complesso IV, inibizione che provoca da un lato una deplezione di ATP e dall’altro un aumento

della produzione di anione superossido perché gli elettroni vengono ceduti all’ossigeno dal

citocromo Q e non dal complesso IV inibito. La SOD non è in grado di neutralizzare l’anione

superossido che così interagisce con NO formando ONOO-, dalla cui scissione si libera radicale

idrossile con conseguente morte cellulare.

Onde evitare la morte neuronale in conseguenza dello stress nitrosativo, interviene una

proteina citoprotettiva con funzione antiapoptotica: HSP-70.

L’NO, infatti, alterando lo stato di ossidoriduzione cellulare e inducendo la deplezione del GSH è

in grado di indurre l’espressione del gene HSP-70. La morte cellulare, quindi, sopraggiunge

solo quando lo stress nitrosativo è eccessivo rispetto alla funzione citoprotettiva svolta da HSP-

70.

HO-SYSTEM (Eme-Ossigenasi System)

L’Emossigenasi o HSP-32 si trova nel reticolo endoplasmatico in un complesso con la

NADPH-citocromo c-P450 reduttasi: la funzione dell’emossigenasi è la degradazione dell’Eme in

Biliverdina e CO; l’enzima NADPH-citocromo c-P450 reduttasi, associato all’emossigenasi,

catalizza la riduzione del ferro dell’eme allo stato ferroso. Solo allo stato ferroso, infatti, il ferro

può legarsi alla transferrina che in questo caso svolge la funzione di proteina chelante il ferro,

evitando così che il ferro libero possa partecipare alla reazione di Fenton.

- La Biliverdina viene conversita in Bilirubina dall’enzima BILIVERDINA REDUTTASI. La

Bilirubina ha funzione antiossidante.

- CO si lega all’eme della NOS bloccando così la produzione di NO.

L’emossigenasi, quindi, è un importantissimo enzima citoptotettivo antiossidante coinvolto

nella conversione di una molecola tossica (Eme) in antiossidanti (Bilirubina e CO).

Esistono tre isoforme di Eme-Ossigenasi (HSP-32):

- HO-1

, isoforma inducibile;

- HO-2

, isoforma costitutiva;

- HO-3

, identificata solo sperimentalmente nelle cellule di ratto.

Particolare importanza riveste la conoscenza dei meccanismi che stanno alla base della

regolazione del gene HO-1, situato sul cromosoma 22.

L’induzione dell’espressione del gene HO-1 è determinata dall’interazione di un eterodimero

che funge da fattore di trascrizione con le sequenze E1 ed E2 (ARE). Tale eterodimero è

costituito da una MAP-protein, attivata dalle MAP-chinasi a loro attivate dalla deplezione di

GSH (stress ossidativo), e dal fattore Nrf-2.

In condizioni fisiologiche, le sequenze E1 ed E2 sono legate ad un repressore trascrizionale,

Bach-1. L’aumento dei livelli di Eme provoca da un lato la dislocazione di Bach-1 dalle

sequenze E1 ed E2; dall’altro lo stress ossidativo provoca una deplezione di GSH che a sua

volta determina l’attivazione delle MAP-chinasi con formazione dell’eterodimero (MAP protein +

Nrf-2). L’interazione di questo con le sequenze E1 ed E2 induce la trascrizione di HO-1.

DETOSSIFICAZIONE

Il fegato è la sede principale della detossificazione di composti tossici endogeni (ammoniaca)

ed esogeni (veleni, farmaci). Il processo di detossificazione consiste in linea di massima nel

modificare le caratteristiche chimico-fisiche dei composti indesiderati rendendoli idrosolubili per

facilitarne l’eliminazione renale.

Le principali reazioni di detossificazione sono:

- Reazioni di Fase 1 : idrossilazione, ossidazione, riduzione, idrolisi;

- Reazioni di Fase 2 : coniugazione con glicina, solfato, acido glucuronico, acetilazione,

metilazione.

Anche l’ureagenesi, durante la quale l’ammoniaca viene incorporata nell’urea, e l’ossidazione

dell’etanolo in acetato e acetaldeide costituiscono processi di detossificazione epatica.

Tra le reazioni di detossificazione, comunque, grande importanza rivestono le reazioni di

idrossilazione. Queste sono catalizzate da una grande famiglia di enzimi ossidativi detossificanti

chiamati complessi CITOCROMI P450. Questi enzimi idrossilano le molecole idrofobiche in

modo da ottenere prodotti più solubili e quindi eliminabili. Questa numerosissima famiglia di

enzimi, catalizza reazioni di idrossilazione utilizzando NADPH e O :

2

RH + O + NADPH + H+ ROH + H O + NADP+, dove RH è un substrato qualsiasi.

2 2

Il sito attivo degli enzimi Citocromo P450 è un gruppo eme contenente un atomo di ferro

legato ad un residuo di cisteina e ad una molecola di H O.

2

Molti dei substrati dei citocromi P450 sono composti lipofilici il cui accumulo potrebbe risultare

tossico per la cellula:

Idrocarburi aromatici policiclici;

- Difenil-policlorurati;

- Fenobarbitali.

-

L’idrossilazione catalizzata dal citocromo P450 converte queste molecole in sostanze

idrosolubili per la successiva escrezione.

Uno degli aspetti più rilevanti del citocromo P450 è che spesso i suoi substrati ne inducono la

sintesi. Questa considerazione costituisce un efficiente meccanismo di detossificazione. E’ ovvio

che le reazioni di idrossilazione catalizzate dal citocromo P450 possano determinare anche la

conversione di sostanze relativamente innocue in composti più tossici.

Ad esempio, l’analgesico Acetaminofene, a dosi elevate, viene convertito in Acetimidochinone

che neutralizza il glutatione dando fenomeni di tossicità.

In tal caso si parla di “biotrasformazione” piuttosto che di detossificazione.

METABOLISMO DELL’ETANOLO

A differenza delle droghe, l’etanolo, in quanto suscettibile di metabolizzazione con produzione

di energia (7 kcal/g, calore intermedio tra glucidi e lipidi), viene considerato uno

pseudoalimento dotato di effetti psicotropi.

A differenza dei comuni alimenti: l’etanolo non può essere depositato; il suo eccesso viene

catabolizzato ed eliminato; è metabolizzato primariamente solo dal fegato e non dagli altri

tessuti.

L’etanolo viene assorbito a livello dell’intestino tenue e in parte a livello gastrico per libera

diffusione. La velocità di assorbimento, quindi, è direttamente proporzionale alla quantità di

etanolo ingerita (gradiente di concentrazione).

Gran parte dell’etanolo assunto viene metabolizzato in CO e H O. Solo una piccola

2 2

percentuale, tra il 5 e il 15%, viene eliminata tale e quale (cioè sotto forma di etanolo)

attraverso l’aria espirata e con le urine.

La capacità di metabolizzare l’etanolo dipende da fattori genetici e varia da individuo a

individuo.

ETANOLO ACETALDEIDE ACIDO ACETICO

 

In maggior misura l’acido acetico viene riversato in circolo e captato dalle cellule

dell’organismo che lo attivano ad Acetil-CoA che entra nel Ciclo di Krebs. Gli organi

principalmente coinvolti nello smaltimento dell’acido acetico sono il cuore e i muscoli striati. In

minor misura viene attivato ad Acetil-coA a livello dello stesso epatocita.

Nell’epatocita l’Acetil-CoA può seguire due vie metaboliche, a seconda della sa concentrazione

intracellulare:

- se la concentrazione è bassa, viene completamente ossidato a CO e H O nel ciclo di

2 2

Krebs;

se la concentrazione è alta, l’Acetil-CoA viene indirizzato verso la biosintesi degli acidi

- grassi e la chetogenesi.

L’enzima che attiva l’acido acetico ad Acetil-CoA è l’ACETATO TIOCHINASI.

Inoltre, quando l’apporto di etanolo è elevato, il fegato diventa incapace di convertire tutto

l’etanolo in acido acetico e riversa in circolo anche acetaldeide.

Gli enzimi epatici che catalizzano l’ossidazione dell’etanolo in acetaldeide sono:

- l’ALCOL DEIDROGENASI (ADH)

- il Sistema Microsomiale Ossidante l’Etanolo (MEOS)

- la CATALASI

In condizioni di assunzioni non elevate di etanolo, l’ADH da sola riesce a metabolizzare tutto

l’alcol. MEOS e catalasi intervengono nel caso in cui i livelli di alcolemia siano elevati.

a. ALCOL DEIDROGENASI

Catalizza l’ossidazione dell’etanolo in acetaldeide a spese del NAD+.

Esistono dieci isoenzimi dell’ADH. Sono stati, infatti, individuati tre distinti loci genici ADH che

codificano ciascuno per una catena polipeptidica:

il locus genico ADH1 codifica per la catena α;

- il locus genico ADH2 codifica per la catena β;

-

- il locus genico ADH3 consta di due alleli, di cui uno codifica per la catena γ1 e l’altro per

la catena γ2.

Essendo l’ADH un dimero, esistono 4 isoenzimi omodimerici (αα, ββ, γ1γ1, γ2γ2) e 6 isoenzimi

eterodimerici (αβ, αγ1, αγ2, βγ1, βγ2, γ1γ2).

Probabilmente la predisposizione e la tolleranza all’alcol dipendono da quale forma

isoenzimatica dell’ADH prevale sulle altre. In questo senso, la capacità di metabolizzare l’alcol

dipende da fattori genetici.

b. MEOS

E’ un’idrossilasi mista associata alla frazione microsomiale che catalizza la reazione:

O + ETANOLO ACETALDEIDE + H O, con contemporanea ossidazione del NADPH a NADP+.

2 2

Il MEOS è un sistema inducibile dall’etanolo. L’ipertrofia del REL, di cui il MEOS è parte

integrante, costituisce una delle prime modificazioni morfologiche conseguenti all’ingestione

cronica di etanolo. Questa ipertrofia rappresenta un fenomeno di adattamento che conferisce al

fegato un’aumentata capacità di metabolizzare l’etanolo. L’etilista cronico è, quindi, in grado di

metabolizzare più efficientemente l’etanolo, per cui dovrà assumere una maggiore quantità di

alcol per ottenere gli stessi effetti psicotropi.

Essendo, però, il MEOS un sistema enzimatico aspecifico capace di idrossilare anche molti

farmaci, il suo potenziamento indotto dall’etanolo si traduce in un aumento dell’efficienza con

cui si estrinseca lo smaltimento dei farmaci. Per questo motivo l’etilista cronico richiede in

genere un dosaggio di farmaci più elevato per ottenere lo stesso effetto farmacologico.

c. CATALASI

Catalizza la reazione:

ETANOLO + H O ACETALDEIDE + H O

2 2 2

In seguito l’enzima ACETALDEIDE DEIDROGENASI catalizza la reazione:

ACETALDEIDE ACIDO ACETICO, con contemporanea riduzione del NAD+ a NADH(H+).

METABOLISMO NON OSSIDATIVO

ETANOLO + AC. GRASSO POLINSATURO ETILESTERE

L’Etilestere si forma in seguito alla reazione di condensazione fra il gruppo alcolico dell’etanolo

e il gruppo carbossilico dell’Acido Grasso. A catalizzare tale reazione di esterificazione è

l’enzima GSH TRANSFERASI. Gli etilesteri possono essere usati come marcatori biochimici

dell’etilismo.

Gli etilesteri sono tossici in quanto:

- disaccoppiano la fosforilazione ossidativa;

- inducono disfunzione mitocondriale perché attraverso la membrana mitocondriale

vengono scrissi nuovamente in etanolo e acidi grassi dalle lipasi. Gli acidi grassi

rimangono intrappolati e si accumulano all’interno del mitocondrio;

disorganizzano le membrane;

-

- inibiscono la sintesi proteica.

L’etanolo a basse dosi viene degradato ossidativamente dal fegato. Ad alte dosi, invece, una

quota direttamente proporzionale alla quantità di etanolo ingerito viene metabolizzata in organi

extraepatici (compreso il cervello) mediante la via del metabolismo non ossidativo.

METADOXIL è l’unico farmaco che abbassa rapidamente i livelli di etanolo nel sangue:

- aumenta la velocità del metabolismo ossidativo, inibendo quello non ossidativo;

facilita l’eliminazione degli etilesteri con le urine, inibendone il riassorbimento a livello

- tubulare.

Viene utilizzato soprattutto nell’intossicazione acuta da alcol.

La CARNITINA favorisce il metabolismo degli acidi grassi: si abbassano i livelli di NEFA che

vengono così sottratti alla GSH TRANSFERASI con diminuzione della formazione di etilesteri.

Oltre gli etilesteri, anche il PROPIONATO e la carnitina vengono utilizzati come markers di

etilismo: nell’etilista cronico il proprionato aumenta mentre la carnitina diminuisce.

BIOCHIMICA CLINICA DELLA CHETOACIDOSI ALCOLICA

La somministrazione cronica di etanolo induce iperchetonemia. Chetonuria si osserva

occasionalmente in pazienti etilisti in corso di intossicazione acuta e la si attribuisce non solo

all’assunzione di etanolo ma anche allo stato di scarsa nutrizione che frequentemente si

riscontra in questi pazienti.

Nella chetoacidosi alcolica (condizione dismetabolica):

lo stato mentale può variare da completamente normale a severamente disorientato;

- si ha disidratazione;

- si ha tachipnea;

- si rivela una diminuzione del Ph arterioso che però è inferiore rispetto alla diminuzione

- caratteristica della chetoacidosi diabetica per l’effetto compensatorio esercitato dal

vomito;

si ha alcalosi metabolica da deplezione di HCl;

- la glicemia può essere bassa, normale o aumentata;

-

- la funzionalità epatica può essere normale o compromessa (cirrosi alcolica diagnosticata

attraverso la biopsia epatica);

si riscontrano livelli molto alti di acido β-idrossibutirrico e livelli moderati di acido

- acetoacetico, per cui se non si misura il rapporto β-idrossibutirrato/acetoacetato e si

valuta solo la concentrazione plasmatica dell’acetoacetato si corre il rischio di

sottodiagnosticare la condizione clinica.

ALTERAZIONI METABOLICHE INDOTTE DALL’ETANOLO

Queste in realtà si estrinsecano solo nel caso in cui la quantità di etanolo ingerito sia elevata,

in relazione peraltro alla capacità individuale di metabolizzare l’etanolo.

Al contrario, un moderato consumo di alcol, in modo ancora più evidente se associato ad

esercizio fisico, induce un aumento del colesterolo legato alle HDL. Questa particolare frazione

del colesterolo avrebbe un’azione protettiva nei confronti della malattia aterosclerotica

coronaria.

L’assunzione di un’elevata quantità di alcol causa invece:

a. Aumento del rapporto NADH/NAD+ determinato dall’attività catalitica dell’ADH.

Questo a sua volta determina:

- aumento del rapporto lattato/piruvato . Il piruvato viene sottratto all’ossidazione ad

Acetil-CoA (piruvato deidrogenasi). Questo porta ad un rallentamento del ciclo di Krebs;

inoltre si riduce la sua carbossilazione ad ossalacetato con conseguente diminuzione

della gluconeogenesi ed ipoglicemia. Il piruvato intraprende la via della fermentazione

lattica catalizzata dall’LDH (lattico deidrogenasi) finalizzata ad aumentare la

concentrazione di NAD+ e quindi a smaltire il NADH. Il continuo smaltimento del NADH

a NAD+ che avviene durante la fermentazione lattica è necessario a far progredire

l’ossidazione dell’etanolo e dell’acetaldeide ad acido acetico. In assenza della

fermentazione lattica si avrebbe una deplezione di NAD+ tale da determinare il blocco

del metabolismo dell’etanolo.

- Aumento della disponibilità di glicerolo-3-fosfato con conseguente aumento della sintesi

dei trigliceridi che in parte si accumulano nel fegato (steatosi) in parte vengono immessi

nel sangue sottoforma di VLDL, la cui concentrazione plasmatica aumenta

considerevolmente. L’aumento della disponibilità di glicerolo-3-fosfato necessario alla

biosintesi dei trigliceridi è dovuto allo spostamento dell’equilibrio della reazione

reversibile catalizzata dall’enzima GLICEROLO-3-FOSFATO DEIDROGENASI verso

destra, cioè verso la formazione di glicerolo-3-fosfato e NAD+.

b. L’abbassamento della glicemia, dovuto sia alla diminuzione della gluconeogenesi che

alla diminuzione dell’apporto glucidico, che rappresenta un aspetto dell’insufficiente

alimentazione che si associa all’ingestione di alcol.

c. L’aumentato rilascio di catecolammine, cortisolo e glucagone, conseguente

all’ipoglicemia. L’ipoglicemia e l’aumento degli enzimi da stress favoriscono la lipolisi

con conseguente aumento della chetogenesi e diminuzione del Ph plasmatico.

d. Il vomito. E’ un meccanismo di compenso nei confronti della diminuzione del Ph.

Determina deplezione di HCl ed alcalosi metabolica che evita l’eccessiva diminuzione del

Ph plasmatico. Determina, però, anche un abbassamento della volemia con

conseguente disidratazione.

e. La tachipnea, anch’essa volta a contrastare l’abbassamento del Ph. Come il vomito, è

un meccanismo di compenso.

DIPENDENZA FISICA

La sindrome d’astinenza da alcol si manifesta mediante reazioni di I, II e III fase.

1. REAZIONI DI I FASE (8-24 h):

Nervosismo

- Debolezza muscolare

- Tremore

- Nausea con conati di vomito

- Tremolio addominale (farfalle nello stomaco)

-

2. REAZIONI DI II FASE (oltre le 24 h):

Aumento della temperatura corporea

- Sudorazione

- Ipertensione

-

3. REAZIONI DI III FASE (48-72 h):

Confusione

- Disorientamento

- Agitazione

- Panico

- Allucinazioni sonore precedute da iperacusia

- Allucinazioni tattili

- Allucinazioni visive

-

- Deficit di sonno REM e accumulo di sogni nello stato di veglia (delirio)

ETANOLO E STRESS OSSIDATIVO

In conseguenza della somministrazione cronica di etanolo si ha un’ipertrofia del REL con

induzione del MEOS. Ciò provoca la formazione del radicale idrossietile e dei ROS con

conseguente aumento della perossidazione lipidica e deplezione di glutatione.

Questi meccanismi intervengono nella patogenesi del danno epatico caratterizzato da necrosi,

infiammazione e fibrosi che possono sfociare in cirrosi.

Un altro enzima coinvolto nella formazione di radicali liberi è la XANTINO OSSIDASI che si

forma dalla xantino deidrogenasi ad opera di un enzima Ca2+-dipendente (CALPAINA).

Un’elevata assunzione di alcol provoca un aumento del rapporto NADH/NAD+, di conseguenza

il ciclo di Krebs rallenta e diminuisce la produzione di ATP.

La ridotta produzione di ATP determina da un lato l’aumento della concentrazione di Ca2+ che

induce la calpaina a trasformare la xantino deidrogenasi in xantino ossidasi, dall’altro la

formazione di ipoxantina dall’ATP. L’ipoxantina viene convertita in acido urico dalla xantino

ossidasi con produzione di ROS:

IPOXANTINA + O ACIDO URICO + O -ׂ

2 2

O -ׂ H O

2 2 2

H O + Fe2+ 2OH + Fe3+

2 2

DOSAGGIO DELL’ALCOL

Quota di alcol consigliata = 10g/die di etanolo

Per risalire alla quantità di etanolo ingerita, bisogna conoscere la gradazione della bevanda

alcolica e soprattutto bisogna considerare che l’alcol ha una densità (peso specifico) inferiore

rispetto all’acqua, pertanto 12 ml di etanolo equivalgono a 10 g di etanolo.

1. BIRRA = gradazione 2,5 % (su 100 ml di birra, 2,5 sono di etanolo)

2,5 : 100 = 12 : x

12 = 12 ml di etanolo equivalgono a 10 g di etanolo

X = volume di birra che bisogna assumere per ingerire 10 g di etanolo

X = 12 x 100 : 2,5 = 480 ml

2. VINO = gradazione 10%

10 : 100 = 12 : x

X = 12 x 100 : 10 = 120 ml

3. WHISKY = gradazione 40%

40 : 100 = 12 : x

X = 12 x 100 : 40 = 30 ml

NATURAL BORN DRINKERS


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limo29

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni)
SSD:
Università: Catania - Unict
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher limo29 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica e Patologia clinica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Catania - Unict o del prof Calabrese Vittorio.

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