Appunti Biochimica delle trasformazioni alimentari

Biochimica

QUANTE PROTEINE

Azoto totale

1. KJELDAHL

Il campione viene mineralizzato con

acidi forti, alta temperatura e

catalizzatori.

Tutto l’azoto presente viene

trasformato in ammoniaca, che in

acido solforico diventa solfato

d’ammonio.

Al termine della digestione con della

soda si converte il solfato

d’ammonio in ammoniaca.

L’ammoniaca viene distillata e

raccolta in una soluzione di acido

che salifica. L’acido residuo verrà

retro-titolato.

Pro

Il metodo di Kjeldahl è ampiamente utilizzato, e rappresenta tuttora lo

standard di riferimento nella pratica industriale e dal punto di vista

legale.

Di fatto, si può applicare a qualunque tipo di materiale, è preciso ed

altamente riproducibile.

Contro

Il metodo non misura esclusivamente le proteine, ma qualunque forma di

azoto ridotto (ammoniaca, urea, acidi nucleici, etc.). Ciascun tipo di

proteina richiede un diverso fattore di conversione, in ragione della

diversa composizione amminoacidica. Il metodo è laborioso, lungo da

eseguire e non automatizzabile. Inoltre, richiede l’uso di composti chimici

aggressivi, utilizzati a temperature relativamente elevate.

Esametilentetrammina

Ottenuta dalla formaldeide e ammoniaca, antibatterico rinvenuto in

campioni di latte cinese.

Il metodo kjeldahl non discrimina queste molecole e questo è un

problema.

Il risultato dell’analisi fornisce un risultato che può essere convertito in:

- Proteine cereali: moltiplicandolo per 5,7

- Proteine animali: moltiplicandolo per 6,25

Questa differenza è spiegata dalla capacità dei cereali contenere più

azoto, questo perché conservano le proteine in forma anidra.

Gli AA che permettono questa modalità di stoccaggio sono due:

- Asparagina

1

Biochimica

- Glutammina

Nella stessa massa possiede due volte la quantità di azoto, vantaggio

evolutivo fondamentale per la germinazione.

2. DUMAS

Il campione viene ossidato

con ossigeno ad alta

temperatura (circa 900 oC)

in presenza di He come gas

carrier, portando al rilascio

di CO2, H2O e N2.

Opportune colonne ad

assorbimento rimuovono:

- CO2

Soluzione di idrossido di

calcio, si crea carbonato

di calcio.

- H2O

Sodio solfato anidro o

solfato di calcio.

Il rimanente N2 passa attraverso una colonna cromatografica, dotata di

un detector a conduttività termica: il segnale del detector è convertito in

contenuto di azoto usando uno standard di EDTA (= 9.59 % N).

Come nel metodo di Kjeldahl, è necessario usare opportuni fattori di

conversione per trasformare la quantità di azoto nel campione in un

valore di contenuto proteico, sempre in ragione della diversa

composizione amminoacidica di ciascuna proteina.

Pro

È molto più rapido del metodo di Kjeldahl (meno di 4 minuti per misura,

rispetto a 1-2 ore per il Kjeldahl). Non richiede catalizzatori o acidi forti. È

facile da usare e si presta ad essere automatizzato.

Contro

Il costo di investimento può sembrare elevato. Anche il metodo di Dumas

non misura esclusivamente le proteine, ma qualunque forma di azoto

ridotto (ammoniaca, urea, acidi nucleici, etc.). Ciascun tipo di proteina

richiede un diverso fattore di conversione, in ragione della diversa

composizione amminoacidica. Il fatto che sia sufficiente una piccola

quantità (mg) di campione può creare problemi di rappresentatività se si

ha a che fare con materiale eterogeneo.

2

Biochimica

Proprietà spettroscopiche

1. NIR

Misura dell’assorbimento

da parte di legami

peptidici in una specifica

regione dello spettro

luminoso, il vicino IR.

Possono essere effettuate

due tipi di misura:

- Fase liquida

- Riflessa

Si parla di NIR per

lunghezze d’onda

comprese tra 800nm e

2500nm.

Le metodologie FT-NIR sono basate sull’assorbimento di radiazioni nel

vicino infrarosso (NIR) a lunghezze d’onda caratteristiche di specifici

legami, ed in particolare di gruppi come C-H, N-H od O-H. Sono sicure,

rapide, cost-effective, non distruttive, e non usano reagent chimici,

solventi o gas.

Gli spettri rilevati vengono trattati con la trasformata di fourier per

ottimizzare l’informazione.

Pro

Nessuna preparazione del campione, nessuno scarto

Non sono richieste particolari abilità all’operatore Estrema velocità di

analisi (1 min. circa)

Analisi simultanea di più componenti nella stessa matrice, perché ogni

legame assorbe ad una lunghezza d’onda specifica.

Adatti per campioni solidi, liquidi, semi-solidi.

Contro

Limiti significativi in termini di precisione e accuratezza. Uno strumento

diverso per ciascun materiale

3

Biochimica

Quantità di campione richiesta

2. UV

Le proteine assorbono in due zone

specifiche dell’ultravioletto, lontano

e nel vicino.

- Lontano UV: legame peptidico

- Vicino UV: amminoacidi aromatici

Molto sensibile, ma è necessario che

il campione sia solubile.

La risposta dipende dalla

composizione della proteina, ed è

sensibile a interferenti.

Soprattutto gli acidi nucleici, la

purezza del campione viene

calcolata con il rapporto tra l’assorbanza a 260nm e l’assorbanza a

280nm.

Riduzione e/o ossidazione dei metalli

1. BIURETO

La reazione crea un composto

facilmente misurabile ed è molto

specifico, poiché necessita di una

particolare conformazione della

molecola azotata.

Semplice e universale, ma

relativamente poco sensibile Molte

interferenze (zuccheri, lipidi,

detergenti, composti riducenti)

Solo il rame +2 dona colore, è instabile e si riduce facilmente.

2. FOLIN E LOWRY

La riduzione del molibdato porta alla formazione di una caratteristica

colorazione blu, facilmente misurabile in VIS a 750nm.

Molto sensibile, ma molto” delicato”:

4

Biochimica

- reagenti instabili

- interferenti comuni (polifenoli, zuccheri, altri agenti riducenti).

Utilizzato poco in sistemi alimentari, poiché molto complessi e ricchi di

interferenti.

Fa eccezione l’analisi del contenuto in polifenoli antiossidanti degli

alimenti. Ù

3. BCA

Acido bicinconínico diventa colorato quando si

lega al rame +1 (B).

In questo modo può essere misurata una

colorazione senza le complicazioni dei Sali

utilizzati nei metodi precedenti (A)

Per avere una reazione occorre però lavorare a

temperature elevate.

Dye binding

Coloranti che grazie alla presenza di numerose zone

idrofobiche si legano alle proteine.

A seguito del legame il colorante limita le capacità di

movimento elettroniche.

Si genera in questo modo uno shift ipercromico, shift

di colore e incremento dell’assorbanza.

Questi metodi di analisi hanno sensibilità estreme,

tra 0 e 50 µg/l di proteine.

Derivatizzazione

Si basa sulla reattività delle proteine e dei loro gruppi specifici. Il principale

gruppo reattivo è l’amminogruppo.

Uno dei reagenti è più utilizzati per rilevare i gruppi reattivi delle proteine è

l’anidrina, che genera un composto colorato e quantificabile.

Ci sono altre sostanze che portano alla formazione di composti fluorescenti.

Si sfrutta quindi la misura di composti derivati dalla reazione tra amminogruppi

e reagenti.

Questo tipo di approccio ci permette di determinare la presenza di proteine

listate, poiché analizzano i gruppi N terminali.

Gli eventi proteolitici sono tipici delle maturazioni dei formaggi.

Domande per la riflessione personale

1. Descrivere un possibile protocollo di valutazione della

digeribilità di una proteina utilizzando comuni metodi di

analisi delle proteine

2. Quali sono le limitazioni dei metodi di analisi basati sulla

spettroscopia infrarossa?

5

Biochimica

3. Quali comuni componenti degli alimenti possono alterare i

risultati di una determinazione proteica basati sulla

complessazione/riduzione di metalli?

4. Cosa differenzia gli spettri UV di proteine ed acidi nucleici?

ACCORGIMENTI OPERATIVI

Sono davvero proteine?

Per rispondere a questa domanda, è necessario:

- Separare da altri componenti solubili, in grado di reagire

aspecificamente con i composti utilizzati nei vari metodi colorimetrici

illustrati nella lezione precedente.

- Separare proteine da peptidi ed altri composti azotati di piccole

dimensioni

La metodologia più semplice e pratica per questo tipo di intervento ricorre alla

precipitazione con acidi caotropi:

- Sulfosalicilico

- Tricloroacetico

- Perclorico

Tutti questi acidi sono estremamente forti (hanno tutti

funzioni elettron-attrattrici che facilitano il distacco del

protone) e sono tutti poco solvati, il che consente loro di penetrare all’interno

della struttura proteica.

Anioni e cationi sono ordinati in base alla loro affinità per l’acqua in quella che

è chiamata «serie di Hofmeister»

6

Biochimica

I tre acidi illustrati nella diapositiva precedente generano anioni estremamente

poco solvatati, in grado di penetrare all’interno della struttura di proteine,

distruggendo le interazioni ioniche, e consentendo l’esposizione di superfici

idrofobiche al solvente.

Le superfici idrofobiche così esposte sono «appiccicose» e tendono ad

interagire tra di loro, formando aggregati proteici, che possono essere troppo

grossi per restare solubili.

La precipitazione con acidi caotropici funziona al meglio:

- con proteine ricche in amminoacidi idrofobici

- a concentrazioni proteiche ragionevolmente elevate (≥ 0.05 g/l)

- in assenza di detergenti e di altre sostanze, come l’urea o il cloruro di

guanidina, che possono rompere i legami idrofobici e dissociare gli

aggregati proteici insolubili formati per azione dell’acido

L’acido sulfosalicilico è tipicamente usato per de-proteinizzare campioni

destinati alle indagini cliniche.

Gli acidi tricloroacetico (TCA) e perclorico sono invece comunemente utilizzati

nelle analisi alimentari.

Dato che la formazione di aggregati insolubili dipende dall’ampiezza delle

superfici idrofobiche esposte, la precipitazione con acidi consente la rimozione

selettiva dei peptidi e delle proteine più grosse tra quelle in soluzione.

Come evidenziato qui sotto, le dimensioni delle proteine che restano in

soluzione sono, approssimativamente, funzione inversa della concentrazione

dell’agente precipitante.

Concentrazione TCA, % Dimensioni (approssimative) delle proteine che

in peso rimangono solubili

5 < 15,000 Da

10 < 10,000 Da

15 < 5,000 Da

20 < 3,000 Da

Applicazioni alimentari della precipitazione con acidi

La precipitazione con gli acidi menzionati in precedenza utilizzata per

distinguere NPN (Non Protein Nitrogen) da azoto proteico in molti studi di

carattere alimentare (ma anche in importanti problematiche cliniche e

diagnostiche).

7

Biochimica

Ad esempio, tra le principali applicazioni in ambito alimentare, vanno ricordati i

seguenti casi:

- presenza di «finte» proteine

Assumendo di avere un alimento in cui sono presenti proteine e materiali

azotati diversi dalle proteine, la precipitazione con TCA serve a rimuovere

dalla soluzione le vere proteine, lasciando in soluzione il materiale non

proteico.

Un semplice dosaggio di azoto condotto sul precipitato o sulla frazione

solubile (sovranatante) ottenuta dal trattamento con acidi consente di

distinguere tra:

Non-Protein-Nitrogen: (NPN), che resta nel surnatante (urea,

nucleotidi, singoli amminoacidi, etc.)

Protein Nitrogen: che rimane invece nel precipitato, che può essere

anche stimato per differenza tra l’azoto totale misurato sul campione non

trattato - e quello NPN

- eventi di “maturazione” proteolitica

La possibilità di separare piccoli peptidi

da proteine consente di verificare il

progredire dei fenomeni di proteolisi che

caratterizzano la «maturazione»

progressiva di molti alimenti, come ad

esempio i formaggi.

Un materiale molto proteolizzato vedrà

aumentare la frazione di NPN (Non-

Protein-Nitrogen) rispetto all’azoto totale

(Total Nitrogen). Quindi, abbiamo una

semplice metodologia per distinguere, ad esempio, un formaggio giovane

da uno stagionato.

La stessa metodologia può essere utilizzata per comprendere e

analizzare gli effetti delle condizioni di processo o di maturazione sulla

velocità ed il decorso di eventi proteolitici.

Nel grafico è riportato il decorso temporale dell’aumento di NPN in

formaggio Cheddar (misurato nella zona periferica e all’interno della

forma), in funzione delle condizioni di temperatura e umidità relativa.

- Suscettibilità alle proteasi (digeribilità in vitro)

Una delle applicazioni più interessanti della precipitazione con acidi

caotropici riguarda lo studio degli effetti di un qualunque processo (o

della scelta di una certa materia prima) sulla sensibilità di proteine

all’azione di comuni proteasi digestive (ad esempio, tripsina e

chimotripsina).

8

Biochimica

In pratica, una sospensione sminuzzata

dell’alimento in esame viene trattata con

una proteasi, che viene lasciata agire per un

certo tempo. L’aggiunta di TCA arresta

l’attività proteolitica e porta alla

precipitazione di tutte le proteine (compresa

la proteasi).

A questo punto, si misura la quantità di NPN

nella parte solubile (spesso basta una misura

dell’assorbanza a 280 nm legata al rilascio di

amminoacidi aromatici).

Il grafico qui accanto indica come un

processo possa modificare in modo molto

efficace la sensibilità di una proteina

all’attacco da parte di enzimi idrolitici.

In questo caso, il trattamento ad altissima

pressione in presenza di zucchero (8000

atmosfere, 10 min. a 25°C) genera una forma solubile ma disavvolta di

ovalbumina, aumentando di 20 volte la

sensibilità della proteina all’azione della

tripsina.

I dettagli operativi del metodo sono

riportati qui a fianco.

QUALI PROTEINE

DIMENSIONI E STATO DI AGGREGAZIONE

La classificazione di Osborne (datata al 1909) divide le proteine in quattro

principali classi di solubilità:

9

Biochimica

albumine Acqua Ovalbumina,

lattalbumina

Globuline Acqua + Sali Proteine da leguminose

Prolammine EtOH, i-ProOH, acidi e Gliadine glutenine in

basi cereali

Scleroproteine Insolubili Peli, unghie etc.

Albumine

Le albumine sono solubili in ambiente acquoso in assenza

di sali in quanto non danno luogo alla formazione di

aggregati.

Come per tutte le proteine, la loro solubilità è minima al

punto isoelettrico. In queste condizioni, la proteina è priva

di carica netta e viene meno la repulsione elettrostatica. Le

cariche residue sulla superficie della molecola possono

portare alla formazione di legami elettrostatici tra proteine

diverse, e quindi a formare aggregati insolubili.

Globuline

Le globuline in ambiente acquoso formano aggregati stabilizzati da interazioni

elettrostatiche. L’aggiunta di sali indebolisce queste interazioni, a causa del

legame degli ioni del sale aggiunto alle cariche presenti sulla proteina, e

aumenta la solubilità della proteina: salting in.

Tuttavia, per tutte le proteine, un aumento della concentrazione di sale porta

alla rimozione dell’acqua di solvatazione che circonda le cariche della proteina,

che si possono avvicinare di molto, e tornare a interagire, formando di nuovo

aggregati insolubili: salting out.

Prolammine e gluteline

Le prolammine e le gluteline sono insolubili in ambiente acquoso perché

formano aggregati stabilizzati da interazioni idrofobiche e, in alcuni casi, anche

elettrostatiche.

L’aggiunta di alcool (etilico o isopropilico) a percentuali superiori al 40-60%

indebolisce le interazioni idrofobiche, a causa della diminuita polarità del

solvente e della distruzione della struttura dell’acqua (non c’è più acqua

organizzata che «schiaccia» entropicamente le zone idrofobiche delle proteine

le une contro le altre), e consente di solubilizzare queste proteine.

In alcuni casi, si possono solubilizzare prolammine in acido acetico diluito o in

basi diluite: a questi valori estremi di pH non ci sono più alcune delle cariche

presenti sulla proteina (quelle positive ad alto pH, quelle negative a basso pH),

aumentandone la solubilità.

10

Biochimica

Scleroproteine

Le scleroproteine presenti in natura sono, di solito, proteine fibrose in cui i

singoli filamenti (i singoli polipeptidi) sono connessi da legami covalenti.

L’unico modo per portarle in soluzione è rompere i legami covalenti (oppure la

loro struttura primaria, con l’uso di proteasi).

Tuttavia, in molti alimenti si formano strutture polimeriche insolubili stabilizzate

da legami disolfuro (formati tramite reazioni di «disulfide exchange» e da

interazioni idrofobiche. L’uovo sodo, il formaggio, la ricotta, la pasta e il pane

sono comuni esempi della formazione di «network proteici» insolubili in seguito

ad interventi tecnologici.

Studi di solubilità differenziale

Informazioni “strutturali” sulla natura dei legami interproteina presenti in un

network proteico (e su eventuali trattamenti subiti dal materiale) possono

essere ricavate da studi di solubilità in presenza di componenti a crescente

capacità dissociante:

1. - sali, non denaturanti agiscono su interazioni ioniche

2. + denaturanti (urea) o detergenti (dodecile solfato) agiscono sulle

interazioni idrofobiche

3. + denaturanti (o detergenti) e riducenti (DTT/2ME) agiscono sulle