Appunti Biochimica delle trasformazioni alimentari

Caratterizzazione di un alimento dal punto di vista proteico

Analisi delle proteine negli alimenti

Primo aspetto: quante proteine ci sono. Si tratta di un aspetto importante sia per l'etichetta sia per la caratterizzazione dell'alimento stesso. Esempio, alimento per celiaci, come faccio a dire che va bene? Non si può semplicemente dire che non c'è glutine (il glutine può esserci ma deve trovarsi al di sotto della quantità che fa male al celiaco, ovvero meno di 20 ppm). Un altro esempio è quello relativo agli allergeni (quantità massima di allergene per poter dire che quel determinato alimento fa male all'allergico). Sulle etichette si trova la dicitura "può contenere..." ma non vuol dire nulla (non ci sono le quantità).

Metodi di determinazione delle proteine

• Metodo Kjeldahl: determinazione dell'azoto totale. Si utilizza acido solforico per denaturare la proteina, in modo tale che tutto l'azoto presente venga trasformato in ammoniaca e infine si titola. L'azoto viene trasformato in azoto proteico tramite l'utilizzo di coefficiente (in funzione della proteina in questione; ogni gruppo di aminoacidi è differente). Inoltre, questo metodo non distingue i peptidi dagli aminoacidi, quindi, Kjeldahl dà solo un'idea della quantità di azoto presente in un alimento. Gli aspetti positivi di questo metodo però sono la comodità, la riproducibilità, l'automazione e il fatto che si può applicare a qualunque tipo di materiale (è uno standard di riferimento). Contrariamente, gli svantaggi sono dovuti al fatto che non misura esclusivamente le proteine ma qualunque forma di azoto ridotto (ammoniaca, urea, acidi nucleici, ecc.). Essendo quindi che ogni proteina necessita di un idoneo coefficiente di conversione, il metodo risulta laborioso e lungo (oltre che non automatizzabile). Infine, tale metodo richiede l'uso di composti chimici aggressivi e utilizzati a temperature relativamente elevate. Esempio: la esametilentetrammina (dalla condensazione di formaldeide e ammoniaca) è un antibatterico, a volte aggiunta in latti in polvere (quindi, latti iperproteici).
• Metodo Dumas: in questo caso si ha ossidazione del campione (con ossigeno), disintegrando i componenti presenti in CO₂, acqua e azoto. Questi tre componenti devono essere separati (CO₂ e acqua vengono eliminati come gas, in presenza di elio in opportune colonne di assorbimento). L'azoto passa all'interno di una colonna cromatografica, che è dotata di un detector a conduttività termica (il segnale viene così convertito in contenuto di azoto, utilizzando uno standard di EDTA). Si vanno poi a determinare le proteine moltiplicando l'azoto per gli idonei coefficienti (in relazione alla diversa composizione amminoacidica di ciascuna proteina). Questo metodo è simile al Kjeldahl ma in questo caso non si ha l'acido ed è molto più rapido (non richiede catalizzatori), è facile da usare ed è molto più automatizzato. Vi sono però svantaggi dovuti al costo elevato (soprattutto per l'elio) e al fatto che anche questo metodo misura non solo le proteine ma qualunque forma di azoto ridotto.

N.B. Questi due metodi possono però essere utilizzati esclusivamente in presenza di campioni con elevato contenuto proteico (se si è nell'ordine dei microgrammi, questi metodi non possono essere utilizzati).

Metodi spettroscopici per la quantificazione delle proteine

• Spettroscopia NIR: utilizza la luce in una determinata fascia (vicino all'infrarosso) che permette di visualizzare specifici legami (in particolare C-H; N-H; O-H). Il campione viene posto in una cuvetta e in seguito colpito dalla radiazione luminosa. In questo modo si ha una rifrazione da parte del campione che verrà analizzata da un software (il quale permette di analizzarne i dati). Si tratta di un metodo facile, veloce, non distruttivo e che non utilizza reagenti chimici, solventi o gas. I metodi visti finora sono distruttivi, contrariamente alla NIR che non lo è. In questo metodo non è nemmeno necessario lavorare sotto cappa e non sono necessarie elevate temperature (contrariamente ai primi due che avvengono a 900-950°C). La NIR è più rapida ma ha un costo più elevato, possiede dei limiti in termini di precisione ed accuratezza (incertezza) e infine, è necessario avere degli standard opportuni, oltre che ad una quantità minima richiesta.
• Assorbimento nell'UV: è un altro metodo spettroscopico. Esso permette la determinazione delle proteine o dei peptidi facendo riferimento all'assorbanza nell'ultravioletto da parte di alcuni aminoacidi aromatici (triptofano, fenilalanina e tirosina). Vi sono infatti alcuni aminoacidi che, se vengono colpiti con lunghezze d'onda particolari, sono in grado di assorbire nell'ultravioletto:
  • Tipica della presenza di un aminoacido aromatico è l'assorbanza a 280 nm
  • L'acido nucleico assorbe l'ultravioletto a 260 nm

Ciò è importante perché, ad esempio, per effettuare l'identificazione di una specie con Real-time PCR, bisogna essere sicuri di aver estratto solo del DNA (eliminazione delle proteine che sono interferenti) e l'unico metodo per assicurarsi di ciò è quello di valutare l'assorbanza nell'ultravioletto. Lo spettro nell'ultravioletto permette quindi di verificare quella che è l'estrazione del DNA da una matrice (ovvero valutando il rapporto di assorbanza tra i 260 e i 280 nm). La valutazione dell'assorbanza a 280 nm viene effettuata spesso per diversi motivi.

Una proteina ha un certo numero di residui aromatici: il triptofano ha un'assorbanza maggiore della tirosina (a parità di concentrazione) e si trova in tutte le proteine. Si può quindi usare l'assorbanza come metodo di misura delle proteine. Però per trasformare l'assorbanza in mg/ml di proteine, devo anche tenere conto del Lambert-Beer, ovvero A = ε × c × l (ε = coefficiente di estinzione molare in base alla retta di taratura). Questo coefficiente delle proteine varia in funzione della proteina stessa (varia in funzione del contenuto di triptofano presente). Esempio: il lisozima ha 6 triptofani mentre la BSA ha 2 triptofani (hanno coefficienti di conversione differenti). Tali coefficienti si trovano nelle tabelle (se si ha una miscela si utilizzano dei valori medi). Nel caso in cui le proteine non possiedano triptofani, si utilizzano invece i coefficienti della tirosina.

Questa procedura di misurazione dell'assorbanza può essere effettuata esclusivamente sui liquidi (che non devono essere torbidi, altrimenti si va a misurare la torbidità e non la solubilità). Quindi, si tratta di un metodo molto sensibile ma è necessario che il campione sia solubile. La risposta dipende poi dalla composizione della proteina ed è molto sensibile a interferenti.

Si ha anche la possibilità di determinare la quantità di peptidi presenti all'interno della miscela. Da essa si tolgono le proteine con un pretrattamento e si lascia la frazione peptidica solubile (o solo gli aminoacidi). Si determina quindi la presenza di triptofano nei peptidi. Ciò però ha un limite, ovvero qualche peptide potrebbe non possedere aminoacidi aromatici (derivano da frammentazione proteine che ad esempio potrebbero non possedere aminoacidi aromatici). Il legame peptidico assorbe a 210 nm o 220 nm quindi, in questo caso, si va ad effettuare una comparazione tra assorbanza a 280 nm e 210 nm (in modo da distinguere all'interno del quadro peptidico, quanti peptidi hanno gli aminoacidi aromatici e quanti invece non li possiedono).

Quest'ultimo aspetto è anche importante quando si va ad effettuare la valutazione dell'attività proteolitica, ovvero si fa agire un enzima che genera peptidi e si va a vedere il rapporto di assorbanza tra 280 nm e 210 nm. Si tiene anche conto però che a 280 nm si possono leggere anche altri composti.

• Riduzione e/o complessazione metalli: sono sempre metodi spettroscopici ma prevedono la produzione di un composto colorato (l'assorbanza sarà vicino alla lunghezza d'onda del visibile). In realtà si può utilizzare anche un colorimetro (simile allo spettrofotometro) che ha una fonte solo nel visibile, prevede l'utilizzo di una cuvetta di plastica e permette di pilotare la colorazione ma è comunque uno strumento molto costoso. Prevedono l'interazione tra il gruppo amminico della proteina (che si va a determinare) e una serie di reazioni di complessazione dei metalli con contemporanee riduzioni. Quindi:
  • Metodo con soluzione di biureto: si basa sulla complessazione tra il gruppo amminico della proteina e il rame 2. Si forma questo complesso di colore viola più o meno intenso (in funzione della quantità). Più si ha colorazione, più è elevata la concentrazione proteica. È un metodo poco sensibile e ha molte interferenze dovute a zuccheri, lipidi e composti riducenti.
  • Metodo di Folin e Lowry: più sensibile del precedente però ha un problema di instabilità dei reagenti. Consiste infatti in una miscela di acidi e composti formati da molibdeno, i quali interagiscono con i gruppi amminici degli aminoacidi, generando un composto colorato blu (che assorbe a 750 nm). Alla soluzione di biureto si aggiunge il reagente Folin – Ciocalteu. Questo reattivo può essere utilizzato come tale per determinare il contenuto totale di polifenoli. C'è una preformazione del trattamento con biureto e poi si ha questa reazione con la presenza del molibdeno.
  • Metodo BCA: complessazione tra una proteina e rame, in presenza di agenti complessanti (acido biconinico che assorbe a 560 nm). La differenza dal biureto è quindi che questa reazione di complessazione avviene in presenza di agenti complessanti. Nella formazione di questo complesso (rame legato alla proteina) si ha un'affinità del complessante maggiore per il rame, rispetto alla proteina (il rame viene strappato alla proteina, formando un complesso colorato). Quest'ultimo è appunto il motivo che aumenta la sensibilità del metodo.

Questi metodi richiedono una retta di taratura, creata con proteine che si avvicinano di più al tipo di proteine che si stanno cercando. Un'altra scelta può essere quella di utilizzare una proteina modello (ad esempio, paragono il contenuto di tutte le proteine rispetto al BSA).

• Metodi che utilizzano coloranti: questi sono già colorati ma variano colorazione quando interagiscono prevalentemente con i legami idrofobici di una proteina (è sempre un metodo spettroscopico). Questi metodi sono:
  • Metodo di Bradford: utilizza il colorante Coomassie Brilliant Blue G250. Questo ha un'assorbanza di 465 nm e quando si lega ad una proteina, l'assorbanza si sposta fino ad un massimo di 595 nm (è blu e la sua tonalità varia a blu più intenso). Questo sistema viene utilizzato molto per la quantificazione proteica ma anche per evidenziare le proteine che vengono separate elettroforeticamente (si vedono tante bande blu per interazione con il colorante). L'interazione tra il colorante e la proteina può essere di tipo idrofobico oppure elettrostatico. Ciò significa che l'interazione con il colorante avviene su diversi residui (idrofobici ed elettrostatici) e che, quindi, non può avvenire su proteine molto piccole (non sono in grado di interagire). Ciò vuol dire che il metodo non funziona sui peptidi o su proteine molto acide (non si hanno sufficienti zone idrofobiche o basiche, rispettivamente). Questo metodo è preciso, non sempre accurato, distruttivo, non necessita di soluzioni estremamente "pulite" (la proteina non deve essere per forza separata) e può quantificare miscele proteiche. Lo svantaggio consiste nel fatto che risente della presenza di agenti che interferiscono nella formazione del complesso, quali ad esempio i detergenti (che hanno zone idrofobiche; come SDS, TRITON).
  • Metodo di derivatizzazione: in questo caso, ciò che viene derivatizzato con una serie di fluorofori, sono i gruppi N-terminali di una proteina o di un peptide. Il bersaglio è quindi l'interazione con un gruppo amminico. Questo metodo viene utilizzato ad esempio per separare gli aminoacidi (che vengono poi visualizzati con questi fluorofori).

Questi metodi possono essere utilizzati anche per la caratterizzazione della digeribilità (i suoi effetti): con Bradford si conoscono quante proteine intatte sono rimaste a seguito della prova di digeribilità, mentre la differenziazione va a vedere tutte le proteine. Con entrambi i metodi quindi, si calcola una differenza che determina quanto è il grado (facendo agire l'enzima la derivatizzazione aumenta). L'utilizzo dello studio di digeribilità, rispetto al Bradford, è complementare.

Caratterizzazione proteine (accorgimenti operativi)

I pretrattamenti servono a togliere eventuali interferenze (serie di composti che possono sfalsare la determinazione). Durante la quantificazione si può ad esempio decidere di determinare i peptidi al posto delle proteine o gli aminoacidi. Ci sono alcuni metodi quindi che permettono di separare la frazione proteica o composti con proprietà diverse.

Acidi caotropi

Esempi: acido sulfosalicilico, tricloroacetico e perclorico. Questi sono in grado di rendere solubili piccoli composti o peptidi e di far precipitare le proteine. Sono molto comodi in quanto il loro effetto dipende dalla concentrazione (si può selettivamente decidere di far precipitare le proteine in base alla concentrazione dell'acido utilizzato). Tali acidi sono tutti acidi forti (facilitano il distacco del protone) e destrutturanti, in quanto sono poco solvati e possono penetrare all'interno della struttura proteica (e quindi denaturarla). Questi acidi generano anioni poco solvatati (lipofili) in grado di penetrare appunto nella struttura proteica, comportando quindi la rottura di una coppia ionica. Di conseguenza, si ha denaturazione della proteina ed esposizione delle regioni idrofobiche (perdita della struttura nativa). La proteina in questo caso tende a raggiungere un equilibrio termodinamico e quindi ad associarsi con altre proteine (formando aggregati proteici che precipitano). La precipitazione funziona meglio in presenza di proteine ricche di aminoacidi idrofobici (altrimenti non si ha tale effetto). È necessaria, inoltre, una minima concentrazione proteica (≥ 0.05 g/L). Un ulteriore aspetto importante è che la precipitazione potrebbe non funzionare in presenza di sali (denaturanti), in quanto essa è basata sulla formazione di associazioni idrofobiche (ad esempio, la presenza contemporanea di urea e guanidina, che sono sali denaturanti, porta alla rottura dei legami idrofobici; danno l'effetto esattamente opposto).

Si hanno preferenze in funzione del target di analisi: di solito si usa l'acido sulfosalicilico quando bisogna de-proteinizzare campioni destinati alle indagini chimiche, mentre il tricloroacetico e il perclorico vengono utilizzati quando si hanno campioni alimentari. Variando la percentuale di acido utilizzato, cambia la quantità di proteine che precipitano. Le dimensioni delle proteine che restano in soluzione sono approssimativamente funzione inversa della concentrazione dell'agente precipitante.

Questa osservazione sta anche alla base delle metodologie utilizzate per andare a determinare l'attività di un enzima proteolitico. Se in generale si vuole sapere quanti peptidi ha generato la proteasi, si fa agire l'enzima per un determinato periodo e si va ad analizzare la formazione di peptidi, facendo un pretrattamento con uno degli acidi che fa appunto precipitare tutte le proteine. La presenza di peptidi viene poi determinata con l'assorbanza a 280 nm.

La determinazione proteica poi viene fatta sul surnatante o sul campione? Precipito il campione con TCA e poi faccio Kjeldahl sul precipitato, in quanto l'obiettivo è quello di determinare le proteine vere e proprie. Se invece si vogliono determinare i peptidi, il metodo Kjeldahl viene fatto sul surnatante. Esempio: la maturazione di un formaggio è un processo idrolitico (forma peptidi). Quindi metto un formaggio in sospensione e lo tratto con acido tricloroacetico (10%, in modo tale da precipitare solo le proteine e lasciare tutti i peptidi in soluzione). Se si vuole andare ancora più in finezza, si va ad aumentare la percentuale dell'acido.

La precipitazione con gli acidi può essere sfruttata anche per distinguere l'azoto non proteico (NPN) dall'azoto non proteico (presenza di "finte" proteine). L'azoto proteico è l'azoto legato alle proteine, mentre l'NPN è legato alla formazione dei peptidi o degli aminoacidi in seguito alla maturazione. Quindi, l'NPN è l'indice utilizzato sempre per seguire la maturazione di un formaggio (concetto che si ricollega a quello precedente). Esempio: formazione di NPN nel cheddar, alla superficie (vicino alla crosta) e al centro, in funzione delle condizioni di temperatura e umidità relativa. L'azione proteolitica è maggiore verso l'esterno che al centro.

Un'ulteriore applicazione è la digeribilità in vitro: il motivo principale di tale applicazione è che ci si è reso conto che non basta l'aspetto compositivo di un alimento (dire c'è tanto calcio, o ci sono tante proteine), perché ciò che c'è nell'alimento non viene assorbito così come tale ma deve essere prima frammentato. Nella frammentazione si ha un evento importante degli enzimi endogeni o della microflora e quindi è diventato necessario simulare questa digeribilità (in vitro). Sono stati creati dei modelli che simulano la digeribilità in vitro (uguale a quella in vivo). Sono sistemi che costano tanto per…