Appunti Biochimica

PROTEINE ANCORATE MEDIANTE MODIFICAZIONE LIPIDICA

Sono legate covalentemente a specifici acidi grassi o lipidi come le molecole isopreniche (in generale, una molecola idrofobica), che si inseriscono nella componente lipidica della membrana; sono proteine spesso coinvolte nella segnalazione cellulare.

PROTEINE INTEGRALI O INTRINSECHE

Queste proteine si inseriscono nelle membrane grazie alla presenza di una parte idrofobica, grazie alla quale si instaurano interazioni non polari con la parte interna della membrana.

GLICOFORINA A 23

La glicoforina A è una proteina della membrana dei globuli rossi. È costituita da un solo segmento transmembrana di 19 aminoacidi. Presenta una porzione extracellulare ricca di carboidrati che costituiscono gli antigeni di singola α-elica istocompatibilità dei gruppi sanguigni. Ha poi una porzione citosolica globulare ricca di aminoacidi carichi (-) che legano le proteine del citoscheletro.

La maggior parte delle proteine attraversano la membrana mediante un'α-elica perché tutti i gruppi aminici e carbossilici, fortemente polari del backbone, formano legami H che stabilizzano questa struttura. Le catene laterali idrofobiche degli aminoacidi sono rivolte all'esterno, in contatto con la porzione idrofobica della catena acilica. Possono presentare una o più α-eliche ("multi-spanning"): possiamo avere l'N-terminale all'interno o fuori, il C-terminale si troverà dalla parte opposta. In caso di una proteina integrale multipasso, il numero di eliche sarà dispari in modo da far stare il C-terminale da parti opposte. La maggior parte delle proteine di membrana possiedono da 2 a 12 eliche TM mentre i trasportatori o carriers da 6 a 12 TM.

BATTERIORODOPSINA

La batteriorodopsina è stata la prima proteina di membrana di cui si è determinata la struttura a livello atomico.

Già dal nome capiamo che è stata isolata e studiata in un batterio (Halobacterium halobium) dove svolge il ruolo di pompa di H+. È costituita da 7 α-eliche TM e ogni elica è costituita da circa 20-22 residui idrofobici (V, L, A, M, F, W) per una lunghezza totale di circa 30 Å. Ci sono soltanto delle piccole anse (costituite da aminoacidi non idrofobici come K, R, D ed E) che sporgono dentro e fuori verso il solvente, il 75% della proteina è immersa nella membrana. Le eliche non sono tutte dritte ma hanno circa un'angolazione, sono tutte a circa 20°. La proteina contiene un gruppo prostetico attivato da fotoni (con la luce si riarrangia da cis a trans) che si chiama retinale 11 cis. Quando il gruppo prostetico si modifica, questo riarrangiamento induce a livello della proteina un cambiamento conformazionale che la fa passare dalla forma inattiva a quella attiva. La batteriorodopsina contiene anche un residuo di prolina che provoca una

Curvatura di un'elica. La struttura di questa proteina è molto simile a quella della rodopsina, presente nelle cellule della retina dei mammiferi. La rodopsina è il recettore della luce e ci permette di vedere.

Scienze biologiche, unibo FM. È molto difficile dissociare una proteina intrinseca della membrana perché è idrofobica (le eliche), bisogna quindi usare detergenti anfipatici, sintetici e ionici o neutri. Questi detergenti staccano la proteina e la isolano ma, nella maggior parte dei casi, ne fanno perdere la struttura.

Un esempio di detergente è il sodiododecilsolfato (SDS): è ionico, molto drastico, è un agente denaturante delle proteine. Presenta una testa carica e una coda idrofobica. I detergenti non-ionici comuni hanno azione più blanda e sono usati in condizioni native. Il detergente anfipatico in acqua forma delle micelle e, in presenza di membrane, il detergente compete con i fosfolipidi per le regioni

Le proteine di membrana sono caratterizzate da regioni idrofobiche. In condizioni ottimali, queste regioni si inseriscono al posto dei fosfolipidi nella membrana. In questo modo, la proteina viene circondata dalle parti idrofobiche del detergente. La struttura della proteina rimane intatta e rimane in soluzione perché svolge una funzione biologica.

La maggior parte delle proteine integrali di membrana ha una struttura ad elica, ma ci sono anche alcune proteine con una struttura a foglietto beta. Queste ultime sono presenti nelle membrane cellulari dei procarioti e esclusivamente nella membrana esterna dei mitocondri. I canali proteici formati dai filamenti beta sono chiamati porine.

Un esempio di porina batterica è costituito da 16 filamenti e ha una struttura simile alla porina mitocondriale TOM40 e ad altre. La superficie interna del canale della porina è idrofila, mentre quella che si affaccia sulle membrane è idrofobica. Questi filamenti presentano...

un’alternanza regolare di residui idrofobici ed idrofilici. Sono dunque filamenti anfipatici. Tra i filamenti si instaurano legami H stabilizzanti. PROTEINE PERIFERICHE Si legano alle membrane (alle teste polari dei lipidi) mediante:

• Interazioni ioniche e legami H
• α-eliche anfipatiche;
• Ansa idrofobica;
• Associazione con proteina integrale.

Le fosfolipasi idrolizzano i legami all’interno dei fosfolipidi: le fosfolipasi A2 idrolizza il legame con l’acido grasso intermedio (è quella che stacca l’acido arachidonico per renderlo disponibile). PROTEINE ASSOCIATE ALLA MEMBRANA Le proteine in generale subiscono un sacco di modificazioni covalenti: possono essere inseriti degli acidi grassi o isopreni che modificano la natura della proteina. La proteina di suo non funziona in quanto tale ma perché viene modificata dopo. (sarcoma): è una delle proteine che inseriscono il gruppo fosfato sulle proteine. L’estremitàN-Proteina chinasi Srcterminale presenta una glicina, all'N terminale vi si lega un acido miristico a 14 C. Abbiamo quindi una modificazionecovalente (la N-miristoilazione) sommata a delle interazioni ioniche che stabilizzano la struttura.

GTPasi Ras p21: è una GTPasi, quindi che idrolizza la GTP. Il GTP è un nucleotide. Forma legami tioesteri, che siottengono mediante modificazioni lipidiche a livello delle cisteine: la cisteina forma un tioestere con una molecola difarnesile (costituite da 3-4 unità isopreniche). Questo legame covalente fa si che non si sposti dalla membrana. (formalegami tioesteri, che si ottengono mediante modificazioni lipidiche a carico della cisteina di una catena polipeptidica eavvengono durante la sintesi della proteina nel RE, mediate da specifici enzimi).

La topologia di una proteina può essere prevista dalle sequenze amminoacidiche? Si certo! Lo spessore internoun'elica di circa

20-24, il gruppo idrofobico di un foglietto fosfolipidico è di circa 30-40 Å, che corrisponde a 6,5 giri di aminoacidi copresenti a questa distanza. Un numero di 22-24 aminoacidi non polari successivi nella sequenza primaria potrebbero costituire un'α-elica.

SPETTRO DI POLARITÀ DEGLI AMINOACIDI

Maggiore è la diminuzione dell'energia libera necessaria per trasferire un aminoacido da un ambiente idrofobico in un ambiente idrofilico, tanto più l'aminoacido è idrofilico. Con valori negativi abbiamo gli aminoacidi molto polari, mentre con quelli positivi abbiamo gli aminoacidi idrofobici.

Con il diagramma di idropatia si calcola la variazione di energia libera in una finestra di 20 aminoacidi lungo l'indice di idrofobicità. In ascissa abbiamo i residui amminoacidici, mentre in ordinata abbiamo un discriminante che indica sopra di esso gli aminoacidi idrofobici e sotto di esso quelli idrofilici.

Questo accade nel caso in cui la sequenza primaria è costituita da...

β-filamenti

Può verificarsi il caso che non si osservino picchi molto alti e questo non da eliche. Non sempre è possibile prevedere la presenza di eliche TM dalla sequenza, alcune proteine globulari hanno estese zone idrofobiche all'interno.

In vivo, le proteine costituenti le membrane sono sintetizzate dai ribosomi associati al RER ed inserite nella membrana del RE per poi arrivare alla loro destinazione finale. Acquistano la loro conformazione durante o subito dopo la sintesi e non la modificano più: non possono ruotare attraverso lo spessore della membrana. Sono però libere di diffondere infretta lateralmente nel piano della membrana. Per misurare questa capacità si può usare la tecnica del recupero della fluorescenza dopo sbiancamento (FRAP). Le cellule vengono marcate con una proteina di membrana fluorescente e su queste viene applicato il fotosbiancamento. Dopo del tempo si verificherà il recupero della fluorescenza.

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unibo FMESPLORAZIONE DELLE PROTEINETECNICHE DI LABORATORIOdi un organismo è l'insieme delle proteine espresse dal genoma: Il proteoma - È più vasto del genoma; - Non è fisso (varia a seconda del tipo della cellula, stadio di sviluppo, condizioni ambientali); - È altamente dinamico; - Rappresenta l'espressione funzionale dell'informazione genetica. Sono noti 14 mila geni nell'uomo. Sono note le sequenze di molti genomi, per esempio nella Drosophila melanogaster si conoscono 23 mila geni ma il numero delle proteine è molto maggiore. Le strategie generali per studiare la struttura di una proteina sono: - Separare della proteina da tutte le altre per ottenerla in forma pura (purificazione); - Determinare la struttura primaria; - Determinare la struttura tridimensionale o folding. Mentre quelli per studiarne la funzione sono: - Non ho bisogno di una proteina purissima come invece accade nello studiodissolte e separate dagli altri componenti cellulari utilizzando metodi come la lisi cellulare, la centrifugazione e la filtrazione; 4. Cromatografia, che permette di separare le proteine in base alle loro proprietà fisiche e chimiche, come la dimensione, la carica e l'affinità per determinati ligandi; 5. Concentrazione, che permette di ottenere una maggiore quantità di proteina purificata riducendo il volume del campione; 6. Verifica della purezza, che viene effettuata utilizzando metodi come l'elettroforesi su gel e la spettrofotometria; 7. Conservazione, che prevede la conservazione del campione purificato in condizioni adeguate per mantenere la sua stabilità e attività nel tempo. 2. FUNZIONE BIOLOGICA Una volta ottenuta la proteina purificata, è possibile studiarne la funzione biologica. Questo può essere fatto attraverso diversi approcci: - Studi in vitro: la proteina viene testata in un ambiente controllato al di fuori della cellula per determinare le sue attività enzimatiche, leganti o altre funzioni biologiche. - Studi in vivo: la proteina viene introdotta all'interno di cellule o organismi viventi per osservarne gli effetti sul metabolismo, la crescita o altre funzioni biologiche. - Studi strutturali: la proteina viene analizzata a livello molecolare per determinarne la struttura tridimensionale e comprendere come questa influenzi la sua funzione biologica. 3. LOCALIZZAZIONE CELLULARE La localizzazione della proteina all'interno della cellula può essere determinata utilizzando diverse tecniche: - Microscopia: la proteina può essere visualizzata utilizzando tecniche di microscopia ottica o elettronica per determinarne la localizzazione all'interno della cellula. - Marcatura fluorescente: la proteina può essere marcata con un fluoroforo per osservarne la localizzazione all'interno della cellula utilizzando la microscopia a fluorescenza. - Frantumazione cellulare: la cellula può essere frantumata e le diverse frazioni cellulari possono essere analizzate per determinare in quale frazione si trova la proteina di interesse. 4. REGOLAZIONE E INTERATTORI La regolazione della proteina può essere studiata analizzando i suoi interattori, ovvero le altre molecole con cui interagisce all'interno della cellula. Questo può essere fatto utilizzando tecniche come l'immunoprecipitazione, la cromatografia di affinità e la spettrometria di massa. In conclusione, la purificazione, lo studio della funzione biologica, la localizzazione cellulare e la regolazione e interazione con altre molecole sono passaggi fondamentali per comprendere il ruolo e il funzionamento di una proteina all'interno della cellula.

Le raccolte possono essere suddivise in base a diversi criteri, tra cui la dimensione e la carica elettrica.