Appunti biochimica

Biochimica

1. Amminoacidi

Gli amminoacidi sono le unità elementari che, unite, danno le proteine. Esistono diverse famiglie di amminoacidi e ogni amminoacido differisce per il gruppo R, da cui dipendono polarità e carica (positiva e negativa). Esistono 20 amminoacidi principali, ma le piante sono in grado di sintetizzarne anche altri, meno importanti. Alcuni amminoacidi non possono essere sintetizzati e sono considerati essenziali. Gli amminoacidi aromatici sono molto importanti, soprattutto la fenilalanina e tirosina, per la sintesi di gruppi fenolici. Alcune molecole possono essere simili ma avere proprietà molto diverse (spettri di assorbimento di luce diversi). Nelle piante, l'accumulo di flavonoidi serve ad assorbire le lunghezze d'onda pericolose (UV 270-290 nm), proteggendo la pianta. Gli amminoacidi sono anfoteri, ovvero la loro carica dipende dal pH. Quando c'è lo stesso numero di cariche positive e negative, ci si trova nel punto isoelettrico, che è diverso per ogni amminoacido.

Cisteina

R = CH₂ – SH. È l'unico amminoacido che può creare legami covalenti X-SH (può ossidarsi facilmente) e partecipa alla struttura 3D delle proteine attraverso ponti disolfuro. I legami sono casuali (quando ne capitano 2 vicine) e la reazione cede due elettroni.

2. Proteine

Molti amminoacidi si legano con un legame peptidico a formare una catena lineare. Il legame peptidico si forma tra l'OH di COOH e H di NH₂ con la perdita di una molecola d'acqua.

Struttura delle proteine

Struttura primaria: catena lineare. Ogni sequenza è dettata dalle informazioni genetiche. Anche solo la modifica di un amminoacido può compromettere la funzione della proteina. Le strutture 3D dipendono dalla sequenza lineare e dai gruppi R che si attraggono o si respingono in base alle interazioni acido-base o forza di Van der Waals.

Struttura secondaria: alfa-elica / beta-foglietto. È un processo di riorganizzazione strutturale. L'ambiente influisce (esempio pH). A seconda degli amminoacidi si può prevedere la struttura secondaria, alfa o beta (in base alla polarità).

Struttura terziaria: avviene grazie alla presenza contemporanea di alfa-elica e beta-foglietto. Comprende 4 anelli eterociclici (gruppo emico). Citocromo = proteine che si legano alla parte non proteica (organica). Riavvolgimento ulteriore e spaziale.

Struttura quaternaria: unione di più catene polipeptidiche sintetizzate singolarmente. Alcuni enzimi si attivano solo con le catene polipeptidiche unite. Glifosate = metodo particolare per il diserbante.

Si può sintetizzare o demolire una proteina in base a quando se ne ha bisogno, ma questo richiede un discreto periodo di tempo (anche 10 min), oppure si può attivare o disattivare la proteina unendo delle subunità precedentemente preparate all'occorrenza. La conformazione nativa è una proteina che ha la struttura corretta cataliticamente attiva; quando una proteina rompe i ponti disolfuro si dice che viene "denaturata" e perde la propria funzione, queste proteine non sono native.

• Temperature alte possono denaturare le proteine (40-45° confine medio).
• La presenza di un fosfato, tramite fosforilazione, fa perdere o acquisire funzioni senza denaturare la proteina.
• Le modifiche a una proteina successive alla conformazione nativa si chiamano post-traduzionali.
• Molte sono reversibili.
• Regolate da un enzima (chinasi).
• Chaperonine = aiutano alcune proteine a riformare la loro struttura naturale.
• Il rinnovo delle proteine è molto importante e deve essere costante (sintesi/demolizione).
• Velocità di sintesi > velocità di demolizione la proteina aumenta.
• Velocità di sintesi < velocità di demolizione la proteina diminuisce.
• Velocità di sintesi = velocità di demolizione proteina uguale.
• Proteostasi = equilibrio dei meccanismi di controllo, della sintesi, conformazione, degradazione e aggregazione proteica.
• Vita della proteina = tempo necessario a sostituire il 50% delle proteine.

Proteine inducibili = proteine indotte in momenti precisi a dare una specificità particolare. Proteine costitutive = proteine presenti dall'inizio. Turn-over = controllo a medio termine.

3. Studio delle proteine

Se da un insieme di proteine devo purificare/isolare una proteina che mi interessa posso utilizzare diverse tecniche:

• Cromatografia per gel di filtrazione: tecnica che sfrutta le diverse dimensioni. Composta da una colonna di vetro con particelle di un polimero poroso in cui faccio passare la mia soluzione. Le particelle piccole riescono a passare nei pori e scendono più lentamente, mentre quelle grosse più velocemente. Le particelle potrebbero avere una polarità e legare solo alcune molecole con una certa carica.
• Cromatografia per affinità: utilizzabile solo se conosco la mia proteina/molecola. Pongo nella colonna alcuni polimeri con dei ligandi che andranno a legare solo la proteina che mi interessa.
• Elettroforesi: consiste nell'applicare due cariche opposte ai due estremi di un gel, le proteine migrano verso il polo corrispondente. Posso denaturare le proteine e renderle tutte di carica uguale, in modo da farle migrare verso lo stesso polo, ma avendo dimensioni diverse migreranno con velocità diverse (piccole più veloci). Se pongo accanto un marker di riferimento posso trovare una corrispondenza. Un altro metodo consiste nello sfruttare il punto isoelettrico (ogni proteina si ferma al proprio punto isoelettrico). Purtroppo esistono molte proteine con lo stesso punto isoelettrico o lo stesso peso molecolare; per questo si utilizza l'analisi bidimensionale per ridurre la probabilità (faccio entrambe le cose).

4. Enzimi

Gli enzimi sono proteine che svolgono il ruolo di catalizzatori nelle reazioni. Formano un enzima: parte proteica (apoenzima o apoproteina), un eventuale cofattore (ione/es. metalli come nell'emoglobina), un eventuale coenzima (componente organica non proteica). Un enzima cataliticamente attivo è definito oloenzima.

Quando ragioniamo in termini di energia stiamo affrontando un problema termodinamico. Il malfunzionamento di un enzima porta a ricadute del metabolismo. Il sito attivo è una tasca interna specifica, la specificità di ogni enzima è una delle caratteristiche più fondamentali. Gli enzimi vengono classificati con dei numeri (4), il 1° rappresenta la classe, il 2° la sottoclasse, l'ultimo lo specifico enzima.

La componente organica degli enzimi è rappresentata dalle vitamine:

• Le piante possono sintetizzare tutte le vitamine, gli animali no.
• Vitamine liposolubili (B) = se in eccesso creano problemi.
• Le vitamine idrosolubili (C) = se in eccesso vengono espulse.

Una reazione per avvenire ha bisogno di un'energia di attivazione. Più la molecola è complessa, più energia libera quando viene scomposta. L'enzima abbassa l'energia di attivazione, velocizzando la reazione (di milioni di miliardi di volte). Tutte le reazioni nella cellula sono catalizzate. L'enzima trasforma il substrato in prodotto ma non modifica l'equilibrio della reazione. La Keq dipende solo dalle caratteristiche dei prodotti e dei substrati:

• Se dG negativo, la reazione libera energia esoergonica (i prodotti hanno meno energia dei substrati).
• Se dG positivo, la reazione richiede energia endoergonica (i prodotti hanno più energia dei substrati).

Catalisi acido-base/catalisi covalente. In generale l'enzima, alla fine della reazione, torna sempre uguale a se stesso, per questa ragione può ripetere immediatamente il processo appena concluso. Anche la concentrazione di substrato influenza la reazione.

La cinetica enzimatica

Quella che andiamo a vedere è una reazione di primo ordine, ovvero la più semplice ma serve a rendere l'idea. Se aumenta la concentrazione di substrato aumenta la velocità, si arriva a una velocità massima. Ogni enzima permette di raggiungere la velocità massima con delle curve differenti. Prendendo un punto intermedio della velocità massima si può notare che per raggiungerlo, i tre enzimi necessitano di concentrazioni di substrato diverse bassa o alta affinità con il substrato. I due parametri che definiscono l'enzima sono quindi:

• Velocità massima (nel primo caso sono tutte e tre uguali, ma non sempre).
• Affinità con il substrato.

La concentrazione di substrato che fa lavorare l'enzima a v max/2 si chiama Kn (se piccola, ha grande affinità e viceversa).

Equazione di Michaelis-Menten

Descrive l'affinità e rappresenta la velocità istantanea.

Inibizione enzimatica

Effetto del pH: ogni enzima ha valori di pH ottimali.

Effetti della temperatura

In un animale si ha una variazione di temperatura solo con la febbre. Nelle piante si verificano costantemente variazioni.

Inibizione retroattiva

Il prodotto si lega alla prima reazione inibendola, infatti se è presente molto prodotto è inutile crearne altro. Modulazione = questo processo non funziona come un interruttore acceso o spento, ma viene modulato continuamente.

5. Bioenergetica e metabolismo

Anabolismo = assorbe energia, costruzione di molecole complesse. Catabolismo = produce energia, partendo da materiale organico passa a materiale inorganico. ATP, NADPH, ecc. hanno un'alta energia chimica e un forte potere riducente. ADP + HPO^2-, ecc., bassa energia chimica. Il processo respiratorio che avviene nei mitocondri si verifica in tutti gli esseri viventi e in tutte le cellule perennemente. Il metabolismo (la somma di tutte le trasformazioni chimiche che avvengono in una cellula o organismo) opera attraverso serie di reazioni catalizzate da enzimi che costituiscono le vie metaboliche. Metaboliti = intermedi metabolici.

Principi di bioenergetica

La bioenergetica è lo studio quantitativo delle trasduzioni energetiche (cambiamenti dell'energia da una forma all'altra). Le trasformazioni seguono le leggi della termodinamica. In qualsiasi modificazione chimica o fisica, la quantità totale d'energia nell'universo resta costante, anche se le forme di energia possono cambiare. In tutti i processi naturali, l'entropia tende ad aumentare.

Energia libera (dG) dG = dH – T dS

• DH = variazione dell'entalpia del sistema
• T = temperatura
• DS = variazione dell'entropia

L'organismo prende dall'ambiente molecole per ricavarne energia restituendo i prodotti all'ambiente. L'ambiente va incontro ad un aumento d'entropia, mentre l'organismo resta in uno stato stazionario e non modifica l'ordine interno. La variazione di energia libera standard di una reazione chimica è un modo per esprimere la costante d'equilibrio.

• Se dG negativo, reazione esoergonica.
• Se dG positivo, reazione endoergonica.

Le variazioni di energia sono additive. Nell'ATP, quando il legame tra due fosfati viene rotto libera una grande quantità di energia. I composti con i carboni più ridotti contengono più energia:

• Processo di ossidazione = libera energia.
• Processo di riduzione = richiede energia.

Tutte le basi nucleotidiche hanno lo stesso valore energetico ma alcune sono più utilizzate. Tutti gli organismi anaerobi per consumare gli zuccheri e produrre ATP usano la glicolisi. L'ATP dG intermedio e per questo funge da moneta di scambio.

NAD e NADP

Attraverso lo spettro di assorbimento si nota che la forma ridotta presenta due picchi, mentre quella ossidata solo uno. Per conoscere la velocità dell'enzima posso misurare l'assorbanza di luce UV dell'NADP.

Catabolismo

6. Glicolisi

La glicolisi (dolce scissione) è la via centrale per il catabolismo del glucosio. Con alcune variazioni, è presente in tutti gli organismi; può differire nei meccanismi di regolazione o per il destino del piruvato. Partendo da una molecola di glucosio vengono prodotte 2 molecole di acido piruvico (da una molecola a 6C a due a 3C). Il carbonio del glucosio viene parzialmente ossidato senza richiesta di O₂ per produrre 2 molecole di ATP. Possono essere distinte 2 fasi:

• Fase preparativa (5 reazioni): vengono utilizzati 2 ATP.
• Fase di recupero (5 reazioni): vengono prodotti 4 ATP e 2 NADH + H.

Non tutti i dG sono negativi, alcuni dG possono essere positivi se sono inseriti in una via metabolica che complessivamente risulta negativa (le reazioni vengono "trascinate" dalle reazioni successive). Tutte le reazioni in cui si somma ATP e si forma qualcosa con il fosforo si chiamano chinasi. Le reazioni ad una freccia sono irreversibili, in quanto la liberazione di energia è sensibilmente negativa, è possibile muoversi al contrario solo utilizzando vie diverse. Esistono due modi per conservare l'energia:

• Sotto forma ATP
• Sotto forma di potere riducente

La glicolisi è una via anaerobica (non richiede O). Glicolisi = dolce scissione.

Fasi della glicolisi

1. Fosforilazione del glucosio:
   • dG = -16,7 Kj/mole irreversibile
   • La presenza di magnesio crea un legame di coordinazione con l’ATP (stabilizza).
   • Formazione di un ATP.
2. Isomerizzazione:
   • dG = 1,7 kj/mole reversibile
   • Richiede Mg.
   • Questa reazione trasforma il glucosio nel suo isomero (isomerasi).
3. Fosforilazione:
   • dG = - 14,2 kj/mole
   • Serve Mg.
   • Formazione di un ATP.
4. Rottura fruttosio:
   • dG = 23,8 kj/mole strano, dovrebbe andare al contrario.
   • Enzima aldolasi = particolare perché unisce i triosi in un esoso, e viceversa.
   • Scissione in due triosi.
5. Interconversione:
   • dG = 7,5 kj/mole potrebbe essere accettabile, ma non in relazione a quella prima.
   • I due prodotti precedenti sono due isomeri, e immediatamente il secondo diventa come il primo.
6. Ossidazione:
   • dG = 6,3 kj/mole troppo strano (3 di fila).
   • Grande liberazione di energia (gruppo aldeidico carbossilico).
   • Il NAD+ si prende il potere riducente e diventa NADH.
7. Trasferimento:
   • dG = -18,8 kj/mole
   • Questa reazione trascina le precedenti (aiutata dalle prossime), in quanto porta via i prodotti.
8. Conversione:
   • dG = 4,4 kj/mole
9. Deidratazione:
   • dG = 7,5 kj/mole
   • L’enzima enolasi forma un doppio legame e fa uscire H₂O producendo la forma enolica.
10. Trasferimento:
    • dG = -31,4 kj/mole
    • Questa reazione risolve tutto in quanto ha un dG molto negativo.
    • All’inizio si crea in forma enolica ma poi, rapidamente e spontaneamente, si converte nella forma chetonica (tautomerizzazione).
    • Fosfoenolpiruvato = PEP (nome corto).
    • Cede P.

Alcuni zuccheri possono derivare da altre parti ed entrare nella reazione bypassando alcuni step (isomeri o epimeri del glucosio).

7. Fermentazione

A questo punto possono verificarsi due casi:

• Presenza di O
• Assenza di O

Se non è presente O è impossibile muoversi lungo la via principale; tuttavia la glicolisi produce piruvato e NADH e se questi prodotti non vengono smaltiti la reazione non procede. La glicolisi però è l'unica fonte di energia e le cellule non possono vivere senza, è necessario quindi smaltire i prodotti. Le uniche due reazioni che possono fare ciò in condizioni anaerobiche sono:

• Fermentazione lattica (animali)
• Fermentazione alcolica (piante)

(Il problema dello smaltimento dell’NADH dipende dal fatto che se non viene smaltito manca il ricevente degli e-, il NAD+).

Fermentazione lattica

Il dG è molto negativo quindi la reazione è favorita, tuttavia non tutte le volte che si crea acido piruvico inizia la reazione, in quanto l’enzima lavora solo in condizioni anaerobiche.

Fermentazione alcolica

Per svolgere la reazione è necessario Mg e TPP (tiammina pirofosfato = vitamina B). L’alcol deidrogenasi è poco presente nei minorenni per questo l’alcol è tossico. Il metanolo e l’etanolo sono competitivi per la stessa reazione ma l’enzima preferisce l’etanolo (il metanolo sarebbe ancora più tossico). La reazione libera CO₂.

8. Ossidazione del piruvato in acetil-CoA

Servono tre enzimi. Il gruppo tiolico attivo SH riesce a creare un legame forte. Acido lipoico.

9. Ciclo di Krebs (ciclo dell'acido citrico o degli acidi tricarbossilici)

L’acetil-CoA con due C viene unito all’ossalacetato con 4 C a formare un composto a 6 C. Alcuni intermedi della reazione sono i chetoacidi corrispondenti di acidi essenziali (amminoacidi). Durante il ciclo di Krebs tutto il carbonio viene ossidato a CO₂ ed il potere riducente finisce in NADH o FADH₂ producendo una piccola quantità di ATP.

1. Reazione = formazione del citrato
2. Reazione = formazione dell’acido isocitrico (trasformazione nell’isomero)
3. Reazione = ossidazione dell’isocitrato in alfa-chetoglutarico. Il prodotto è importante per l’assimilazione di N. Tutte le reazioni hanno dG negativo, quindi accumulano energia e producono potere riducente.
4. Reazione = ossidazione dell’isocitrato in alfa-chetoglutarico a succinil-CoA. Legame tioestere = legame ad alta energia.
5. Reazione = conversione del succinil-CoA a succinato. Sintetizza GTP, facilmente convertibile in ATP.
6. Reazione = ossidazione del succinato a fumarato. Unica reazione che richiede FAD.
7. Reazione = idratazione del fumarato a dare malato. Entra acqua.
8. Reazione = ossidazione del malato ad ossalacetato.