Applicazioni cliniche delle biotecnologie mediche

Introduzione alle tecniche diagnostiche

L'attività di medicina di laboratorio fornisce informazioni ottenute con metodi chimici, fisici o biologici su tessuti o liquidi di origine umana o su materiali connessi alla patologia umana, ai fini di:

• Prevenzione
• Diagnosi (confermare o escludere l’ipotesi diagnostica iniziale e raggiungere una diagnosi certa)
• Monitoraggio e decorso della malattia
• Ricerca clinica

Almeno il 70% di tutte le decisioni diagnostiche prese in ambito medico sono influenzate dai test di laboratorio. Oltre alla visita clinica vengono spesso prescritti degli esami del sangue.

Laboratorio diagnostico

I laboratori non sono tutti uguali: le prestazioni offerte sono dipendenti dalla strumentazione che possiedono e ciò è dipendente dalla realtà sanitaria oltre che dall’ambito in cui lavora il laboratorio.

Test diagnostico ideale vs reale

Il test diagnostico ideale è un test capace di discriminarmi con esattezza tutti gli individui sani da quelli malati. In una rappresentazione grafica le due popolazioni sono rappresentate da due gaussiane che non si sovrappongono. Nel test diagnostico reale invece ci sono falsi positivi e falsi negativi, quindi ci sono sovrapposizioni delle due gaussiane che possono essere ridotte con l’aumento della specificità e sensibilità del test.

Parametri che definiscono l'accuratezza del test diagnostico

Sensibilità del test: definisce la capacità del test di discriminare sani da malati. Per valutarne l’efficacia si studia una popolazione di cui conoscono malati e sani. Sarà del 100% se tutti i soggetti malati noti sono identificati come malati dal test. Un test sensibile è scelto quando le conseguenze di una mancata diagnosi potrebbero essere particolarmente gravi.

Specificità del test: definisce la capacità del test di individuare come negativi i pazienti sani. La percentuale di specificità del test è definita dal numero di soggetti sani negativi / i soggetti sani totali. Il test specifico è particolarmente utile per confermare una diagnosi già effettuata con altri mezzi.

Valori predittivi di un test

Possono essere positivi o negativi:

• Il valore predittivo positivo è la probabilità che un soggetto positivo al test sia effettivamente malato: ciò è definito dal rapporto fra il numero di soggetti malati positivi al test / i soggetti positivi totali.
• Il valore predittivo negativo è la probabilità che un soggetto negativo al test sia effettivamente sano: ciò è definito dal rapporto fra il numero di soggetti sani negativi al test / i soggetti negativi totali.

È importante conoscere queste percentuali relative al test per poter decidere in ambito diagnostico quale può essere il test più opportuno qualora ci siano più test fra cui scegliere.

Passaggi per l’arrivo all’esame di laboratorio:

• La richiesta del medico
• La raccolta del campione
• L’analisi del campione
• Il controllo dei risultati
• La validazione clinica dei risultati che comporta la loro presentazione sotto forma di referto

Referto

È il prodotto di un complesso processo di significazione a più passaggi che trasforma il dato di laboratorio in una informazione clinica utile alla cura del paziente. Ne esistono almeno due livelli:

• Tecnico che è sample-oriented
• Clinico che è patient-oriented

Ciclo diagnostico e gestione del processo diagnostico

Il ciclo diagnostico parte dalla definizione del problema clinico e ritorna al punto di partenza dopo il test diagnostico con la sola differenza che a quel punto si possiedono più informazioni per poter analizzare il problema. Spesso possono essere necessari più cicli diagnostici con test diversi per poter arrivare a possedere le informazioni necessarie a risolvere il quesito iniziale.

Tecniche diagnostiche: batteri e virus cutanei

La cute sana è colonizzata stabilmente da un gran numero di microrganismi che vivono come saprofiti sulla sua superficie, impedendo la colonizzazione di agenti potenzialmente patogeni. La flora residente è di norma composta da:

• Funghi
• Batteri aerobi (i più numerosi, sono ad es. Stafilococchi, Difteroidi, Micrococchi) e anaerobi
• Acari dei follicoli piliferi e delle ghiandole sebacee (Demodex folliculorum dei follicoli piliferi e brevis delle ghiandole sebacee)

La flora residente ovviamente può essere soggetta a condizionamento dando vita ad una flora transiente che prende spazio sulla cute a causa di fattori che condizionano lo stato integro della barriera cutanea.

Fattori condizionanti la microflora cutanea

• Sede corporea
• Ospedalizzazione (flora ≠, cariche microbiche elevate e batteri inusuali)
• Età
• Razza
• Medicazioni (occlusioni che aumentano tenore idrico o disinfettanti)
• Alterazioni metaboliche

La pelle integra è una valida barriera e non permette l’attecchimento dei microrganismi, a causa di pH acido, immunità innata e adattativa e la presenza della flora commensale. La cute può essere superata dai germi in zone sottoposte a traumi oppure tramite iniezioni di farmaci contaminati. Altra fonte di infezione è l’uso di apparecchi medicali intra- ed extra-vascolari. L’epidermide fa parte del SI innato dal momento che i cheratinociti sono in grado di liberare alcuni fattori per il SI, inoltre possiedono recettori per rispondere a stimolazione da parte del SI. Inoltre, sono presenti cellule del Langherans e cellule APC.

Infezione della pelle

Per fare ciò l’agente infettivo deve poter aderire alla cute, penetrare la barriera e soppiantare la flora microbica residente. La virulenza di tale agente infettivo identifica la capacità relativa di tale agente di provocare una malattia ed è definita dal numero minimo di cellule richieste per incominciare un’infezione stabile.

Infezioni sessualmente trasmesse (IST)

Sono le infezioni più diffuse dopo quelle respiratorie in Europa e la loro incidenza è in aumento, le più comuni sono: clamidia, gonorrea, epatite C, sifilide, epatite B ed HIV. Generalmente non è richiesto l’esame specifico per una determinata malattia, ma in casi sospetti oppure per favorire una diagnosi differenziale può essere richiesto. Per quanto riguarda invece patologie recidivanti e/o resistenti a terapia antibiotica è obbligatorio l’esame colturale con antibiogramma.

Gonococco

Causa la gonorrea che è una malattia a trasmissione sessuale con una incidenza diversa in funzione della popolazione studiata. L’agente eziologico è Neisseria Gonorrhoeae ed è un diplococco GRAM-, prevalentemente intracellulare che aggredisce i PMN e gli epiteliociti, inducendo una flogosi acuta o cronica. Può scatenare diverse patologie in dipendenza dalla sede di infezione. Sono particolarmente gravi le infezioni nel neonato durante il parto.

Esami diagnostici per gonococco

Esame colturale: il prelievo può essere sia endocervicale e uretrale, ha una sensibilità del 95% nelle sedi genitali mentre in altre sedi dell’80%. È il più specifico e permette di eseguire il test di suscettibilità antibiotica (antibiogramma + test immunoenzimatico). Le colture richiedono che gli essudati siano inoculati in un terreno idoneo (es. terreno modificato di Thayer-Martin) e incubati a 35-36°C per 48h in un'atmosfera contenente il 3-10% di CO2. Alcune colonie sono visibili dopo 24h ma la maggior parte compare dopo 48h.

Esame diretto al microscopio: con colorazione di Gram o con colorazione monocromatica con blu di metile. Si ha diagnosi in tempi rapidi ma si può effettuare solo su campioni cervicali o uretrali. È raccomandato solo nei casi sintomatici:

• Nell’uomo lo striscio su campione uretrale è più sensibile nei soggetti sintomatici (90-95%) che asintomatici (50-75%).
• Nella donna il test su campione endocervicale è più sensibile che su quello uretrale, ma è comunque un test meno sensibile (45-65%) e specifico che nell’uomo.

Con la colorazione di Gram uso un doppio colorante → in sequenza prima uso il violetto di genziana poi la fucsina basica: una volta tolto l’eccesso del primo colorante, viene fissato e viene aggiunto il secondo. Di nuovo viene lavato l’eccesso e si monta il vetrino. I batteri gram+ risulteranno violetti mentre i gram- risulteranno rosa/rossi.

Test Immunoenzimatico: alternativa all'esame colturale, non può essere utilizzato come unico criterio per una diagnosi di laboratorio. Sfruttano in modo accoppiato una reazione immunologica (legame antigene-anticorpo) per legare selettivamente la molecola ricercata, e una reazione enzimatica per produrre un segnale colorato facilmente misurabile con appositi fotometri. La componente immunologica del test per il gonococco ne assicura la specificità (89-92%) mentre la componente enzimatica ne assicura la sensibilità analitica (88-99%), rispettivamente per le femmine ed i maschi.

Test di ricerca del DNA batterico: valida alternativa all'esame colturale (20-30% più sensibile) e all’EIA (25-75% più sensibile). Possono essere utilizzati su prelievi uretrali ed endocervicali, ma anche su campioni di urina (con minore sensibilità). I test NAAT presentano una specificità del 99,5%.

Il campione deve essere inviato al laboratorio in fretta (15’) o conservarlo a RT, perché se è materiale fresco deve arrivare fresco o muore durante il tragitto, se non è ben conservato posso fare un’analisi del DNA ma se devo fare un esame colturale non cresce nulla.

Herpes simplex virus

È responsabile di una comune infezione di pertinenza muco cutanea a trasmissione interumana. Ci sono due tipi antigenici di Herpes simplex virus:

• HSV1 per lo più responsabile dell’Herpes simplex labiale e di lesioni alla parte superiore del corpo
• HSV2 a trasmissione sessuale responsabile dell’Herpes simplex genitale e di lesioni alla parte inferiore del corpo

Esami diagnostici per herpes virus

La diagnosi di infezione erpetica è semplice quando le manifestazioni sono tipiche, in caso di quadri clinici atipici o per la diagnosi differenziale con altre malattie infettive o neoplastiche deve essere sempre confermata da test di laboratorio che consentano l’identificazione del virus.

Esame citodiagnostico (prima scelta): lo striscio di materiale cellulare viene prelevato dal fondo e dalle pareti della vescicola e colorato con colorazione Giemsa. L’analisi citologica rivela cellule giganti multinucleate con tipico aspetto del nucleo a vetro smerigliato e inclusi intranucleari. Richiede personale esperto. La citologia, se confrontata con l’esame colturale, offre una buona specificità (90%) ma una sensibilità sulle lesioni genitali scarsa e variabile a seconda della localizzazione.

Ricerca diretta del DNA virale: il virus può essere isolato dalle vesciche cutanee. Il test viene generalmente effettuato nel caso di esito negativo all’esame colturale ma con sospetto clinico persistente di un’infezione da HSV. È un test maggiormente sensibile rispetto all’esame colturale pertanto è utile nel caso in cui il virus sia presente in basso numero o nel caso in cui il campione provenga da una lesione vecchia di qualche giorno. Questo metodo è il migliore per rilevare una meningite, encefalite o cheratite (infiammazione della cornea) virale da HSV.

Diagnosi sierologica: metodo indiretto usato quando i test diretti non sono praticabili o in assenza di lesioni attive, prevede la ricerca degli anticorpi anti-herpes simplex tipo 1 e 2 (HSV1 e HSV2) IgM e IgG. Di difficile interpretazione ai fini diagnostici.

Ricerca anticorpi anti-IgM: in corso di infezione primaria si evidenziano nel siero a partire dal 7° giorno dalla comparsa delle lesioni, raggiungono il titolo massimo tra la 4° e la 6° settimana e persistono per 8-12 settimane.

Ricerca anticorpi anti-IgG: in corso di infezione primaria compaiono dopo 6-7 settimane dall’infezione e persistono per tutta la vita. In caso di reinfezione ci possono essere aumenti ma è comunque difficile costruire una curva anticorpale precisa.

Isolamento virus in coltura: posso farlo a partire da secrezioni o da tessuti e dopo inoculazione in colture cellulari di derivazione umana o animale, rappresenta il metodo diagnostico di riferimento per sensibilità e specificità. Con le metodiche in uso circa l’80% dei campioni positivi è individuato nel giro di 4 giorni, con una sensibilità che sale al 95% se l’osservazione degli effetti citopatici del virus nelle colture cellulari è protratta fino a 7 giorni. Per prelievi da casi asintomatici o per campioni con carica virale bassa è necessario un periodo di osservazione di 10-14 giorni. Tutti i campioni con effetto citopatico sospetto vengono confermati da prove di Immunofluorescenza indiretta o di ibridazione molecolare.

Varicella zooster virus

La varicella è l’infezione primaria, a carattere epidemico, del virus. Rimane a livelli dei gangli dorsali. L’herpes zoster è la sporadica dello stesso virus che persiste in fase di latenza nei gangli spinali e quindi porta a reinfezione a causa della riattivazione del virus (fuoco di Sant’Antonio). La varicella e l’herpes zoster sono causati dallo stesso virus a DNA, il virus varicella-zoster a diffusione ubiquitaria. I test per la rilevazione degli anticorpi o del Virus della Varicella Zoster (VZV) non vengono utilizzati per la diagnosi di varicella o di herpes zoster poiché è sufficiente la diagnosi clinica sulla base dei segni e sintomi del paziente.

Esami diagnostici varicella zoster virus

È difficile porre la diagnosi in fase pre-eruttiva che può essere invece posta con facilità dopo la comparsa delle vescicole. La diagnosi differenziale si può porre con il papilloma virus HPV.

Indagini sierologiche: nel caso in cui il clinico voglia valutare lo stato dell’immunizzazione di un paziente che andrà incontro a situazioni particolari come gravidanza, trapianto etc. ad o infezione in corso.

Ricerca diretta del DNA virale: nel sangue (+EDTA) mediante PCR nel caso sospetto che un neonato o una persona immunocompromessa sia stata esposta al virus della varicella.

Esame citodiagnostico: rivela cellule giganti multinucleate.

Isolamento in coltura: non molto ripetibile, da falsi negativi.

Test di Tzanck (esame citodiagnostico)

Usa la colorazione classica GIEMSA, quindi ho: nuclei viola, i citoplasmi basofili in blu e i citoplasmi acidofili in rosa. È utile per trovare cheratinociti con degenerazione palloniforme in caso di infezione da HSV o ZV. Il test di Tzanck è usato sia per determinare la diagnosi delle infezioni causate da virus herpes e virus zoster che nella diagnosi di pemfigo (malattia bollosa autoimmune).

Tecniche diagnostiche: parassiti, miceti e protozoi

Miceti

Sono organismi uni- o pluricellulari esosaprofiti (dipendenti da sorgenti organiche di carbonio), sono aerobi e crescono più velocemente a 20-25°C e a pH neutro. Possono causare micosi infettando la pelle, i capelli, le unghie e le aree genitali e possono avere forma filamentosa (ife) o rotondeggiante (spore). I principali responsabili delle micosi superficiali sono i dermatofiti e i lieviti.

Lieviti

Funghi semplici, monocellulari, che si riproducono per gemmazione; la cellula gemmata resta adesa alla progenitrice, formando così fragili catene cellulari dette pseudoife.

Dermatofiti

Funghi filamentosi che formano una struttura fittamente ramificata e intrecciata (micelio aereo e vegetativo) costituita da ife, filamenti cavi provvisti di setti trasversali. I dermatofiti sono i responsabili delle dermatofizie o tigne. Hanno un particolare tropismo per le strutture cheratiniche.

• Tinea capitis: micosi contagiosa tipicamente di età pediatrica, porta a perdita di capelli e peli con desquamazione ed eritema. L’infiammazione è più intensa quando è provocata da miceti zoofili.
• Tinea corporis: micosi spesso dovuta al contagio da animali infetti.
• Tinea pedis: (piede d’atleta) dermatofizia più comune nei paesi industrializzati.
• Tinea unguium: infezioni degli annessi ungueali soprattutto dei piedi.

Diagnosi di micosi

La natura micetica di una affezione cutanea e/o mucosa, già sospettata in base a elementi clinici, va sempre documentata attraverso la dimostrazione del micete. In caso di negatività e in presenza di lesioni fortemente sospette, gli esami vanno ripetuti in tempi diversi e in punti diversi della lesione.

Indagini di laboratorio

• Dimostrazione del micete (circa 40 specie) nelle lesioni
• Isolamento del micete sui terreni di coltura
• Identificazione di genere e di specie sulla base dei caratteri macroscopici, microscopici e fisiologici del micete isolato

Esame clinico con luce di Wood

Il test non è specifico, è scarsamente sensibile ed è importante eseguirlo dopo aver fatto riscaldare la lampada UV-A 365nm per almeno 5-10 minuti. Per indirizzare meglio il dermatologo verso peli e croste da prelevare per quei dermatofiti che sono produttori di pteridina. Può dare falsi positivi a causa di squame, unguenti, pomate, fili etc.

Ectothrix: infezione da dermatofiti che rimane confinata alla superficie dei capelli.

Endothrix: infezioni da dermatofiti che invadono il fusto del capello ed entrano nello stelo del capello. Utilizzando la lampada di Wood le infezioni endothrix non danno fluorescenza mentre alcune infezioni ectothrix possono dare fluorescenza giallo-verde.