Antropologia molecolare - la metodologia classica

La metodologia classica

Il recupero e il prelievo dei campioni

La fase iniziale per lo studio dei campioni dei reperti antichi prevede il recupero del campione osseo. Il materiale viene raccolto con particolari accorgimenti, forniti dall’antropologo, e vengono riportate sulle schede tutte le informazioni relative alla giacitura, al recupero e allo stato di conservazione del reperto.

I resti dovrebbero sempre essere manipolati da un operatore che indossa un camice sterile, guanti e mascherina per evitare contaminazioni. I campioni devono poi essere imbustati in sacchetti sterili. Tra le informazioni utili da riportare a chi si occuperà delle successive fasi sperimentali si hanno:

• Datazione del reperto: meglio se eseguita sul campione;
• Tracciabilità della contaminazione: si effettua attraverso tipizzazione genica degli operatori che hanno manipolato il reperto. È importante anche conoscere tutti i trattamenti subiti dal campione e la natura del terreno in cui questo è stato ritrovato (solitamente si preleva un campione di terreno in prossimità del reperto);
• Dati archeologici e morfologici: in base a questi si decide come procedere con le analisi;
• NMI (numero minimo di individui): se si ha a che fare con campioni prelevati da una sepoltura multipla è importante capire il numero di individui presenti per evitare di falsare gli studi popolazionistici. Per questo, oltre a studiare il mtDNA, che non consente di verificare se due campioni con lo stesso mtDNA appartengono allo stesso individuo o a due individui imparentati fra loro (si potrebbe trattare infatti di fratelli), si studia anche il DNA nucleare.

Il prelievo dei campioni deve essere eseguito in modo tale da non alterare in maniera apprezzabile la morfologia del campione e da non introdurre variazioni che possano compromettere le successive fasi analitiche. Una volta in laboratorio, il reperto osseo deve essere pulito. È necessario eliminare eventuali tracce di DNA endogeno da tutta la superficie, rimuovendo con carta abrasiva uno strato superficiale di 1 mm. Ciascuna superficie viene poi irradiata ortogonalmente per 45 minuti con raggi UV a 254 nm per rendere non contaminante l’eventuale DNA endogeno presente. Dopo queste operazioni si può procedere con il recupero della polvere ossea. Nel caso di resti scheletrici è possibile ricavare dalle ossa lunghe un tassello cuneiforme in modo tale da non interferire con eventuali rilievi antropometrici successivi oppure si può impiegare un microcarotatore. Nel caso in cui la polvere ossea sia estratta da un dente (la dentina è contenuta nella radice) si effettua un carotaggio. Non si può estrarre DNA da denti decidui o che presentano fessure o carie. Per la rocca petrosa invece si ricava una sua sezione attraverso l’uso di seghe circolari diamantate. Questa sezione viene poi sterilizzata con i raggi UV. Il campionamento della polvere ossea viene effettuato con un trapano dentistico che polverizza la parte d’interesse.

Per l’estrazione del DNA bastano 50 mg di polvere ossea che può essere conservata a -20°C. Per allontanare dal campione sostanze inibitrici delle diverse fasi sperimentali, i protocolli di estrazione si basano sull’uso della guanidina idrocloruro che guida all’adsorbimento del solo DNA da parte di particelle di silica. Gli altri componenti in soluzione vengono lavati via con lavaggi a base di etanolo. Il DNA viene così eluito e conservato a -20°C per le successive analisi.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

I metodi di cui si dispone per analizzare la struttura del DNA sono metodi indiretti poiché, non essendo in grado di leggere direttamente una sequenza di DNA, è necessario farne delle copie dalla cui analisi si riesce a ottenere informazioni sulla struttura di partenza. Copie di DNA vengono prodotte in vitro grazie a una reazione enzimatica che prende il nome di PCR e che è in grado di riprodurre in poche ore miliardi di copie di un particolare frammento di DNA. Questa metodica richiede un limitato numero di reagenti ed è facile da attuare.

Affinché un ciclo di reazione si compia, però, devono prodursi un numero elevato di interazioni tra le molecole presenti in soluzione. Gli errori che possono insorgere nel corso della duplicazione si traducono nella produzione di copie non fedeli all’originale. Il fenomeno risulta tanto più serio quanto minore è il numero delle copie di partenza ed elevato il numero di cicli di amplificazione cui il DNA viene sottoposto. Ciò risulta tanto più grave se il DNA che viene amplificato è a sua volta affetto da lesioni che codificano la struttura primaria come nel caso del DNA antico.

Un prerequisito indispensabile per la PCR è la scelta di una porzione di DNA da analizzare (non più lunga di 200 bp) di cui sono note le sequenze delle estremità 5’ e 3’. Nella reazione sono infatti coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (primer) complementari uno all’estremità 5’ e l’altro all’estremità 3’. La coppia di primer costituisce l’innesco dell’attività della DNA polimerasi (Taq DNA polimerasi). La scelta dei primer è un’operazione abbastanza semplice in quanto esistono in rete programmi gratuiti che, una volta inserita, la sequenza da amplificare, sono capaci di costruire coppie di primer specifiche per quel frammento che vengono poi sintetizzate in laboratorio. Ci sono regioni del DNA in cui la variabilità da individuo a individuo è minore e la cui sequenza è nota perché depositata in banche dati. Sono queste le regioni impiegate per l’attacco dei primer che si legano anche se la sequenza non è perfettamente complementare.