Antropologia

NGS NEW GENERATION SEQUENCING

Si tratta di analisi di sequenziamento di seconda generazione. Si parte non da un genoma amplificato, ma da un DNA che viene estratto e lavoriamo su librerie a DNA, cioè andiamo a costruire le library, quello che vogliamo andare a leggere. Con NGS riusciamo a vedere tutto ciò, costruiamo sull'estratto il panorama molecolare dell'estratto, poi dipende da cosa siamo interessati a vedere. Anche in questa tecnologia c'è stata un'evoluzione, il sequenziatore Illumina riesce a sequenziare fino a 3 tera di DNA. Grazie all'utilizzo della tecnica NGS è stato possibile capire come si distingue un DNA esogeno da uno endogeno.

Come si costruisce una library: al frammento di DNA di cui vogliamo fare la library (che non ha mai le estremità piatte nel doppio filamento ma sempre sfalsate), dobbiamo aggiungere due frammenti di DNA sintetici che si chiamano adattatori. L'esempio che analizziamo è la...

costruzione di una library per la 454FLX, cioè il pirosequenziamento, il primo sistema di sequenziamento NGS. Prima di aggiungere gli adattatori dobbiamo rendere le estremità piatte, cioè fargli avere la stessa lunghezza, e poi aggiungere gli adattatori alle due estremità, che chiameremo A e B. Se vado a denaturare il frammento e mi concentro solo su uno dei due filamenti, avrò una sequenza del tipo B-frammento-A. A questo punto si crea la library che può essere conservata a -20 gradi. La cosa interessante è che con il work flow (modus operandi) della 454FLX entra in gioco l'utilizzo di micro bilie che hanno sulla loro superficie tanti adattatori che sono complementari o all'adattatore A o all'adattatore B. Si fanno reagire le molecole prodotte dalla library con le micro bilie e quello che succede è che l'adattatore sul frammento si appaia a quello complementare sulla micro bilia. La cosa interessante è che

quando facciamo una library, si misura con un bio analyser la lunghezza dei prodotti della library e con un real time PCR la quantità di molecole che ho generato con la library. Quindi, se ho generato un miliardo di molecole, e voglio che ciascuna si complementi con l'adattatore presente su una singola bilia, devo avere almeno un miliardo di bilie (o di più anche meglio), così potrò avere un unico filamento per ciascuna bilia. Una volta avvenuto l'appaiamento con le bilie, si mettono in un'emulsione, su cui avviene una PCR emulsioclonale, cioè il filamento appaiato alla bilia si riproduce finché trova complementarietà di adattatori liberi sulla bilia. Alla fine della PCR, si ottiene il frammento amplificato sulla bilia. Siccome tutti i frammenti prodotti dall'emulsioclonale hanno subito lo stesso processo, avrò miliardi di bilie sulle quali è avvenuta l'amplificazione di un frammento.

Queste punto le bilie vengono messe in un micro reattore, che è una superficie con tantissime cellettine (tipo alveare) nelle quali può entrare una singola bilia. A questo punto si mette in un sequenziatore 454 che legge i frammenti, attraverso una reazione dipirosequenziamento, e così ottengo tutte le sequenze dei frammenti che vanno a descrivere il panorama molecolare dell'estratto.

Grazie a questa tecnica è stato ricostruito per la prima volta il DNA mitocondriale dell'uomo di Neanderthal e un milione di sequenze genomiche dell'uomo di Neanderthal.

I problemi riguardanti il sequenziamento della libreria con NGS sono due: il primo è che la libreria che genero contiene tutto ciò che ho estratto; il secondo è che la tecnologia può sequenziare fino a 20 milioni di base per corsa, se dovessi sequenziare un intero genoma umano, che sono 3 miliardi di nucleotidi, devo moltiplicare almeno per 100 per avere il genoma.

Questa tecnologia è molto utile quando sequenziamo degli ampliconi (prodotti di amplificazione) così ottengo il panorama molecolare del prodotto di amplificazione per cui si potrebbe utilizzare al posto del clonaggio. Questo sistema può essere utilizzato non solo per la parte di carattere evolutivo ma anche in ambito identificativo. Se faccio un profilo STR su due gemelli monozigoti ottengo due profili uguali, quindi teoricamente due gemelli monozigoti potrebbero compiere un crimine e non si potrebbe dire chi dei due è stato facendo il profilo STR. Se però prendiamo i prodotti di amplificazione dei polimorfismi possiamo osservare che all'interno dei polimorfismi di lunghezza e leggiamo le sequenze, lunghezza possono esserci mutazioni che si sono sviluppate nel corso della vita della persona e quindi distinguerli. Poiché questa metodica può sequenziare fino a 20 milioni di basi, è altrettanto importante pensare che con

Questa metodica può leggere contemporaneamente più molecole. Se faccio l'amplificazione di una molecola di DNA mitocondriale, lunga 16mila pb circa, la suddivido in diversi frammenti perché devo fare più amplificazioni se voglio ricostruirla tutta. Considerando che i frammenti sono lunghi circa 160 pb, farei 100 frammenti e quindi 100 amplificazioni. Quindi poiché il massimo di amplificazione è 20 milioni e il mitocondrio è 16mila pb, facendo il rapporto posso leggere il mitocondrio 1250 volte. Poi nella realtà sarà meno perché nel prodotto di amplificazione ho diverse basi con la stessa sequenza, ma comunque lo leggo in maniera molto approfondita. Per cui posso pensare di mettere insieme più prodotti di amplificazione mitocondriale provenienti da individui diversi, magari li leggo meno approfonditamente ma comunque meglio del clonaggio. Se metto due mitocondri a sequenziare riduco il massimo di lettura per ciascun mitocondrio.

Il problema che si pone è come fare a distinguere a quale campione appartiene la libreria. Quando si parla di NGS posso inserire nelle librerie i tag, cioè un riconoscimento, che nella tecnologia 454 si chiama mid. Questo è una sequenza di DNA nota che inserisco tra un adattatore e la sequenza di DNA da leggere e così riesco a capire se questa sequenza appartiene o non appartiene alla libreria che ho costruito. Quindi con la tecnologia NGS posso mescolare differenti campioni e grazie all'inserimento di particolari sequenze di riconoscimento io posso ricondurre la sequenza al campione e quindi all'individuo di cui voglio leggere il DNA. Questo approccio prende il nome di pulling. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso di leggere in maniera molto dettagliata il primo DNA mitocondriale dell'uomo di Neanderthal. Questo è uno studio molto importante, fatto da Adrian Biggs, che attraverso una metodica particolare è riuscito a catturare.

Frammenti di DNA e poi asequenziarli con la tecnologia 454. La tecnologia molecolare che ha utilizzato è la primer estractioncapture, PEC. Questa è una tecnica che permette di selezionare frammenti di DNA, catturarli e poi sequenziarli. La PEC è una tecnica molto costosa, infatti esiste anche una tecnica che funziona allo stesso modo ma meno costosa. La PEC si basa sulla costruzione di oligonucleotidi che sono complementari al frammento di DNA che voglio catturare. Per sviluppare la cattura devo fare diversi oligonucleotidi. Nel dettaglio, l'oligonucleotide ha una sequenza complementare al frammento di interesse, una sequenza spaziatrice e alla fine di questa una molecola di biotina, che si complementa a una molecola di streptavina, che a sua volta sta su una bilia magnetica. Succede che l'oligonucleotide trova il frammento a lui complementare, avviene l'estensione delle estremità e il frammento di mio interesse diventa DNA a doppio filamento.

(viene catturato dal primer PEC). A questo punto si fa interagire il primer PEC con la bilia che contiene la streptavina. Poi si prende un magnete e si attira il frammento che viene portato via dalla soluzione con tutti gli altri frammenti, quindi lo catturo. Se tutto questo processo lo faccio su una libreria a DNA, il frammento da catturare avrà un adattatore A, uno B, un mid e il primer PEC che si attacca. Una volta catturato denaturo il primer e il frammento catturato lo sequenzio con il work flow 454. In questo caso non sequenzio un prodotto di amplificazione ma un frammento di DNA, cioè quello che ho catturato. Per cui dato il trouth put è di 20 milioni, in questo modo il frammento lo posso leggere molte più volte rispetto all'intero mitocondrio. Il fatto di poter leggere tante volte la stessa molecola è molto importante perché posso vedere se la molecola ha degli errori e anche perché attraverso gli errori posso rendermi conto se ho ache fare con del DNA esogeno o endogeno. Grazie allo studio di Adrain Briggs siamo riusciti a capire come poter distinguere il DNA esogeno da quello endogeno, perché potevamo leggere molte volte un filamento. Il background è tutto ciò che c'è e che non vogliamo catturare. Amplificare una libreria significa arricchirla, cioè aumentare il numero di copie che contiene. In ogni caso, se si arricchisce troppo può inficiare il risultato. Amplificare la libreria con PCR, con primer complementari all'adattore A e B, rende i frammenti più catturabili (e mantiene anche gli errori che sono eventualmente presenti nella sequenza). Di solito si fa una PCR emulsioclonale che è quella del workflow della 454. L'estrazione viene da un frammento di osso lungo che è il femore. Le ossa che rendono meglio per l'estrazione sono le rocche petrose e i denti. Dopo l'amplificazione si fa la purificazione del DNA. Mettendo a 95gradi la soluzione il primer si denatura e rimane attaccato alle bilie che si trovano attaccate alle pareti del tubo perché attratte dal magnete, mentre il DNA catturato entra in soluzione, che viene quindi rimossa e utilizzata. mtDNA position è la posizione della base sul DNA mitocondriale. Coverage (copertura) indica quante volte viene letta la base. Facendo la media della lettura di ciascuna base si trova la media di lettura del DNA mitocondriale. La coverage delle basi permette di distinguere il DNA endogeno da quello esogeno. Quindi lo studio di Adrian Biggs, fatto con la tecnica della PEC, ci ha permesso di capire che i neanderthaliani erano una popolazione fatta di pochi individui e la loro variabilità genetica non era molto alta. Inoltre abbiamo dimostrato che i neanderthaliani avevano il DNA mitocondriale diverso dai sapiens. Su tutte le molecole di DNA dell'estratto. Dopo di che, quando prepariamo una libreria, lo facciamo avremo una sequenza di riferimento di.DNA mitocondriale umano e ci possiamo immaginare che non ci siano tante differenze con quello neanderthaliano, per cui quando costruisco i primer PE, la sequenza del mitocondrio umano. In questo modo.