Antropologia

NGS

Si tratta di una serie di tecnologie che permettono di sequenziare genomi completi in un tempo

ristretto in modo tale di ricostruire le dinamiche evolutive della nostra specie. Il termine NGS vuol

dire letteralmente New generation sequencing. Questa tecnica rappresenta una vera e propria

rivoluzione rispetto alla metodologia classica. Infatti, mentre la metodologia classica poteva essere

applicata solo in alcuni casi (DNA mit di individui di cui conosco la storia tafonomica ossia la

storia del campione che mette in luce anche le possibili manipolazioni che questo ha subito negli

anni, il DNA mit dei Neanderthal e dei Sapiens in quanto differiscono l'uno dall'altro e DNA

nucleare di Neanderthal che contiene alleli ancestrali specifici per questa specie), la tecnologia NGS

può essere applicata a tutti i genomi. Infatti, con questa tecnica è possibile distinguere il DNA

esogeno da quello endogeno e dunque possiamo analizzare campioni che sono stati manipolati da

vari operatori e scartare quelli troppo contaminati. All'interno della tecnologia NGS è presente sia

una prospettiva mitocondriale che è una prospettiva nucleare ,infatti oltre a poter ricostruire genomi

completi, possiamo ricostruire il DNA mitocondriale traendo due principali benefici: Innanzitutto

ricostruendo il genoma mitocondriale possiamo ricavare la storia evolutiva ,anche se al femminile

di una popolazione e attraverso l'analisi dello stato di conservazione dei mitocondri possiamo capire

anche che probabilità abbiamo di ottenere un buon DNA nucleare per capire poi come muoverci nel

trattarlo. Inoltre, rispetto la metodologia classica esistono una serie di passaggi che possono

effettivamente essere molto più semplici da fare e che forniscono un'affidabilità maggiore. I

problemi di questa tecnologia è che i costi sono elevati e che solo alla fine del percorso possiamo

capire se i dati ricavati dal campione sono utili o meno. Ad ogni modo il flusso di lavoro della NGS

prevede diversi step.

1) Inizialmente il DNA viene estratto da reperti ossei localizzati in specifici distretti. Tra questi

reperti ossei, non si utilizzano reperti postcraniali (presenti invece nella metodologia classica) ma si

utilizzano la rocca petrosa che è un osso posto sotto al cranio e i denti. Estrarre il DNA dalla Rocca

petrosa è un processo complesso per due motivi. Innanzitutto, poiché le rocche petrose sono

attaccate al cranio, queste devono essere staccate e durante la procedura possono rompersi, inoltre

una volta staccate le rocche petrose vengono divise in due parti in modo tale da estrarre il materiale

genetico in una determinata zona detta punto c. Nel caso in cui il DNA venga estratto dal dente

viene fatto un buco nella radice e viene prelevata la polvere d’osso. Nonostante questo processo

abbia una resa minore, si preferisce estrarre il DNA dal dente in quanto è una procedura più

semplice. Infatti i denti possono essere estratti e riattaccati facilmente e inoltre possono trovarsi in

contesti anche molto differenti.

2) ad ogni modo, una volta estratto, poiché il DNA è antico è molto probabile che questo sia

degradato e che abbia misincorporazioni in 5’ e 3’. Infatti, la degradazione del DNA può avvenire

su tutta la molecola e a causa di diversi fattori, tuttavia in un DNA degradato, le miss incorporazioni

sono molto frequenti in posizione 5’ e 3’ con una prevalenza di C verso T e di A verso G. Dunque,

molto probabilmente, le estremità di questa molecola non saranno piatte. Pertanto, inizialmente

ricostruisco le estremità piatte in 5’ e 3’ utilizzando la Polimerasi T4 che agisce sia a destra che a

sinistra del mio frammento. Una volta che la PolT4 ha reso le estremità del frammento di DNA

piatte e alle estremità del frammento inserisco degli adattatori ossia degli oligonnucleotidi noti

(detti adattatori A e B).A questo punto ho costruito una libreria di DNA contenente tutti i frammenti

di DNA presenti nell’estratto. Costruire una libreria significa rendere immortale tutto il DNA

contenuto nell’'estratto come DNA esogeno DNA estratto, DNA batterico, DNA fungino e così via.

Infatti, a differenza della PCR non abbiamo uno specifico target ma, grazie alla costruzione delle

librerie a DNA, otteniamo il panorama molecolare di tutto ciò che ho estratto. Una volta costruite le

librerie queste possono essere lette e sequenziate mediante due tecniche: la tecnologia del

pirosequenziamento detta anche 454 GS 20 o la tecnologia illumina. La tecnica 454 GS 20 ci ha

permesso di condurre i primi studi sul genoma di neandertal, Infatti è il primo strumento NGS che

ha consentito di sequenziare grandi quantità di DNA. Nel corso degli anni il sequenziamento, nella

tecnologia NGS si è passati dall’ABI Sanger (10^2 frammenti per corsa), al 454 GS20 (10^5)

frammenti per corsa, illumina GA2 (10^8) frammenti per corsa e infine illumina HiSeq 10^9

frammenti per corsa.

Tecnica del priosequenziamento o 454GS

Nella tecnica del pirosequenziamento la libreria prima viene denaturata in modo tale da lavorare

su singoli filamenti di DNA (lavoro solo con uno tanto l’altro è complementare). Successivamente,

la libreria viene fatta interagire con delle microbilie che presentano sulla loro superficie degli

adattatori A e B complementari a quelli presenti nei frammenti di libreria. Il numero di microbilie

numero di molecole generate all’interno della libreria. Questo valore,

impiegate varia a seconda del

che può essere stimato mediante la RTPCR è molto importante in quanto ci permette di capire

quante bilie usare, ma comunque sia generalmente il numero di microbilie impiegate è superiore

rispetto alla concentrazione della mia libreria. Ad ogni modo, i frammenti di librerie (rappresentati

da singoli filamenti di DNA) si attaccano agli adattatori presenti sulla superficie delle microbilie e

una volta attaccati questi vanno incontro a polimerizzazione. Affinchè possa avvenire la

polimerizzazione, le bilie, contenenti il frammento di libreria, devono essere introdotte in un

ambiente particolare creato da un’emulsione. Nell’emulsione, si verifica la cosiddetta PCR emulsio-

di libreria attaccato all’adattatore della bilia viene riprodotto a partire

clonale, per cui il frammento

dall’adattatore, successivamente si stacca e si attacca a un altro adattatore che lo riproduce

nuovamente. Questo processo dura finché sono presenti adattatori nella bilia, quando tutti gli

adattatori saranno saturati dal legame con i frammenti di librerie riprodotti, la PCR emulsio clonale

si interrompe, l’emulsione si rompe e le microsfere vengono inserite in piastre contenenti tanti

piccoli fori detti micro-reattori. Questi fori vengono detti micro-reattori in quanto in ciascun foro

sono presenti i reagenti necessari per il pirosequenziamento. A questo punto, i microreattori

vengono inseriti nella macchina adibita al sequenziamento e in ciascun microreattore il frammento

di libreria che ho amplificato sulla bilia viene letto al fine di ottenere il panorama molecolare della

libreria che ho generato a partire dall’estratto. Le letture ottenute da questo sequenziatore si chiamano

Reads.

Dunque con il piro sequenziamento posso sequenziare il DNA amplificato ottenendo il

panorama molecolare del prodotto di amplificazione e vedere la composizione di tutte le molecole

che ho amplificato. Questa tecnologia può corrispondere al clonaggio della metodologia classica ma

ho prodotti più ampi rispetto al clonaggio.

Utilizzo di tag

Le librerie possono essere taggate, ossia oltre agli adattatori A e B, all’interno della libreria posso

inserire un frammento di DNA che è specifico per quella determinata libreria. Questo frammento di

DNA agisce da tag e dunque, una volta che la libreria sequenziata è stata letta, ci permette di capire

a quale campione appartiene quella specifica libreria. Taggando le librerie, è possibile quindi

mescolare e sequenziare più librerie assieme in quanto ciascuna di esse ha al suo interno uno

specifico tag, ossia una specifica sequenza di DNA. Infatti, quando andrò a leggere la libreria di

DNA, oltre alla sequenza del frammento di DNA, leggerò anche il tag che mi permetterà di capire

che quel frammento di DNA sequenziato appartiene a quella determinata libreria che ho costruito a

partire da un determinato amplificato e quindi da un determinato estratto. Grazie a questo

meccanismo posso analizzare e sequenziare un numero maggiore di campioni, circa 10^ 5, 10^7

molecole sequenziate per corsa. Nel flusso di lavoro della 454 questi tag si chiamano MIT e sono

circa una ventina quindi teoricamente posso processare 20 libreria insieme e andare

successivamente riconoscere.

I tag sono stati utilizzati in un progetto condotto da Adrian Briggs finalizzato a ricostruire il genoma

completo di 5 mitocondri appartenenti a 5 differenti uomini neandertaliani. Il DNA mitocondriale è

lungo circa 10^4 pb quindi se vado a sequenziare il DNA mitocondriale di un uomo posso leggere

circa 100 volte in modo tale da avere un’informazione estremamente ampia.

ciascuna base

Utilizzando i tag abbiamo detto che possono sequenziare e leggere più DNA mitocondriali insieme

in quanto ciascuno di questi verrà associato a un opportuno tag. Anche se inserisco più mitocondri

insieme ho comunque una lettura del genoma molto ampia, infatti nel nostro caso leggendo 5

mitocondri avrò una profondità di lettura, ossia un numero di volte con cui può essere letto il

frammento di DNA, di 20 (100:5).

Primer extention capture

Per distinguere il DNA mitocondriale da tutto il DNA che ho estratto (da un reperto osseo), Adrian

Briggs ha utilizzato una tecnica nota come primer extention capture (PEC). Il principio su cui si

basa la PEC è andare a catturare i frammenti di DNA della libreria che voglio sequenziare. Pertanto,

dal reperto neandertaliano, è stato estratto il DNA e a partire dagli estratti è stata costruita la libreria

a DNA contenente oltre agli adattatori, anche il tag. Successivamente, grazie alla PEC, i frammenti

vengono selezionati, catturati e rimossi dal contesto in cui si trovano. Dunque, in questa tecnica,

vengono sviluppati dei primer PEC ossia dei frammenti di oligonucleotidi con una molecola di

biotina all’estremità complementari al frammento di DNA neandertaliano che voglio catturare. Per

andare a catturare tutto il DNA mitocondriale avrò bisogno di numerosi primer pec che consentono

di coprire tutta la lunghezza del DNA mitocondriale che essendo dell'uomo neanderthaliano non è

più circolare ma è frammentato. Inizialmente, i primer PEC si attaccano alla zona del frammento di

DNA neandertaliano a loro complementare, in questo modo un complesso dato dai primer PEC e

dal frammento di DNA catturato. Successivamente, per rimuovere il frammento di DNA

mitocondriale di mio interesse da tutto il contesto della libreria, utilizzo delle biglie magnetiche che

presentano sulla loro superficie delle molecole di streptavidina. Queste molecole sono

complementari alla biotina, pertanto si legano ad esse e si forma il complemento biotina-

streptavidina. Successivamente, mediante un magnete posso rimuovere le biglie contenenti la

streptavidina complessata alla biotina del primer PEC (legato al frammento di DNA di mio

interesse). in questo modo posso estratte i frammenti di DNA mitocondriale di mio interesse.

Questi, dopo esser stati estratti, seguiranno il flusso della 454 GS, pertanto si inseriranno nelle

biglie contenenti adattatori A e B, seguiranno poi la PCR emulsio clonale e verranno sequenziate.

Molto spesso le librerie di DNA vengono arricchite in modo tale da aumentarne le copie. Per fare

ciò basta amplificare la libreria mediante una tecnica detta target enrichment Capture ossia cattura

del materiale arricchito. Infatti, spesso nel DNA antico non si costruisce direttamente la library e si

sequenzia ma si fa un’operazione nota come “target enrichment”. Questo arricchimento selettivo

utilizza delle sonde legate a biglie magnetiche che catturano molecole a loro complementari. In

questo modo, una volta che il DNA della libreria si è ibridato alle sonde, con un magnete catturiamo

il pool di sonde per poi analizzare le molecole di campione.

Questa tecnica vari vantaggi in quanto consente di avere un numero maggiore di target, permette di

analizzare anche frammenti molto corti e mantiene inalterate le caratteristiche molecolari delle

molecole estratte dai campioni.

Con la tecnologia NGS è possibile analizzare il genoma di individui vissuti nel passato anche senza

conoscere la loro storia tafanomica. Inoltre, grazie a questa tecnologia, è possibile distinguere il

DNA endogeno dal DNA esogeno in modo tale da valutare la bontà del campione ossia la quantità

di DNA endogeno presente a suo interno. In questo modo, in base a questa quantità, sarà possibile

decidere se scartare o meno il risultato. Innanzitutto sappiamo che il DNA antico è fortemente

degradato e presenta Miss incorporazioni particolarmente frequenti in posizione 5’ e 3’ con una

prevalenza C verso T. La degradazione del DNA coinvolge tutta la molecola, tuttavia essendo

l'estremità 5 primo tre primo scoperte a livello delle estremità vi è un numero di c verso t maggiore

rispetto al resto della catena. La prevalenza di miss incorporazioni può essere associata al DNA di

un individuo vissuto nel passato in quanto le sequenze mitocondriali dei Nenanderthal possono

essere distinte da quelle delle altre specie e analizzando queste sequenze si è visto che all’estremità

5’ e 3’ le missincorporazioni erano molto presenti, infatti generalmente il numero di miss

incorporazione che posso trovare è 20/30, dunque su 100 molecole 20/30 avranno miss

incorporazioni e le altre no. .Per questo motivo le misincorporazioni possono essere considerate

come dei marcatori dell’antichità del DNA recuperato. Inoltre, sapendo che la sequenza del DNA

mitocondriale dei Neanderthal è differente da quella dei Sapiens, possiamo stabilire che dei

frammenti analizzati appartengano a un individuo Neadertaliano oppure no.Per poter individuare

con certezza le miss incorporazioni deve essere prodotto, mediante la PEC, un quantitativo molto

alto di letture che mi consentono di ricostruire l’intera molecola di DNA mitocondriale. Abbiamo

detto che il numero di missincorporazioni che posso trovare all'interno del DNA antico è di 20/30

(non tutte!), ciò significa che su 100 molecole solo 20,30 avranno miss incorporazioni alle

estremità. Pertanto per distinguere del DNA antico che non ha miss incorporazioni da del DNA non

antico che tuttavia manca anch’esso di miss incorporazioni posso basarmi sul motivo della sequenza

che differisce dai Neanderthal alle altre specie homo. Quindi, se ho un DNA mit frammentato e

altre molecole di DNA non frammentate ma con lo stesso motivo di sequenza ho a che fare con

DNA endogeno. Infatti, il DNA antico privo di missincorporazioni viene confrontato con il motivo

del DNA contenente missincorporazioni, se i motivi corrispondono fanno parte entrambi di un

individuo vissuto nel passato.

Pertanto il DNA endogeno può essere distinto da quello esogeno sulla base delle CT in 5’ e 3’ e

sulla base dei pattern di frammentazione che sono molto alti nei campioni antichi. Grazie a questo

metodo dunque è possibile recuperare delle informazioni che possono poi essere utilizzate per fare

delle inferenze sugli individui vissuti nel passato e ricostruire la loro storia evolutiva. Tuttavia,

prima di fare ciò, bisogna essere sicuri di avere a che fare con un genoma antico. A tal proposito si

può utilizzare un software noto come MAP DAMAGE che va a leggere le miss incorporazioni in 5’

e 3’ presenti in un pattern di reads generate sequenziando le librerie (generate dal DNA mit

neandertaliano e quelle generate dal DNA contaminante). Infatti, solo grazie al sequenziatore NGS

(illumina)che fornisce un elevato numero di letture, un elevato numero di dati è possibile giungere a

queste conclusioni.

Le miss incorporazioni tendono a diminuire passando da individui neanderthaliani 30-40% agli

individui Sapiens dove arrivano a essere pari a 0. Nei Sapiens non vi sono miss incorporazioni e le

estremità sono piatte pertanto conoscendo il motivo delle sequenze neandertaliane siamo sicuri che

non sono Neanderthal e quindi sono necessariamente Sapiens.

ILLUMINA

Con la metodologia NGS, le librerie possono essere lette anche con la tecnica Illumina. Il flusso di

lavoro di Illumina prevede:

- Estrazione del DNA nella clean room

- Costruzione librerie Illumina a partire dagli estratti nella post index room

- Cattura e target enrichment

- Analisi bioinformatica delle sequenze

Inizialmente, a partire da un frammento osseo viene estratto il DNA. La molecola di DNA, essendo

antica, risulta essere fortemente degradata con le estremità 5’ e 3’ non piatte. Pertanto, inizialmente

grazie alla T4 polimerasi vengono riparate le estremità inserendo degli errori. Una volta ricostruite

piatte, in 5’ e 3’ vengono inseriti, mediante una ligasi, due adattatori detti P5 e P7.

le estremità

Questi adattatori hanno una sequenza uguale nota ma una lunghezza diversa. Gli adattatori hanno

un’estremità piatta e una impari. Questo meccanismo serve per far sì che gli adattatori si leghino

alla molecola del campione nella direzione corretta. Successivamente, mediante una polimerasi si

estende il filamento di DNA laddove mancava e si ricostituiscono le estremità piatte. A questo

punto, con una RT PCR con pochi cicli vengono inseriti i tag che in questo caso prendono il nome

di indici, in questo modo dunque sarà possibile sequenziare insieme più campioni. Infine, avviene il

sequenziamento. Con illumina possono sequenziare un numero molto maggiore di molecole per

corsa (non più 10^5/10^6 come nella 454). Questa differenza dipende dal fatto che non si

impiegano più delle biglie ciascuna legante un frammento di DNA ma si ha un cluster di librerie

ciascuna con il proprio indice.