Antibiotici della sintesi proteica

Antibiotici inibitori della sintesi proteica

Fino ad ora abbiamo visto uno dei meccanismi principali con cui avviene l'inibizione della crescita dei microorganismi, ossia il blocco della sintesi della parete cellulare, indispensabile per la sopravvivenza dei microorganismi. Ma non è l'unica struttura indispensabile al batterio per vivere, infatti ha bisogno sia di acidi nucleici che di proteine. Il vantaggio dell'inibizione della parete batterica rispetto agli acidi nucleici e alla sintesi di proteine è che la parete è una struttura unicamente batterica, laddove invece anche le cellule di organismi superiori sono in grado di trascrivere e tradurre gli acidi nucleici, quindi è ovvio che agendo sulla parete batterica abbiamo una tossicità selettiva più elevata.

Tuttavia però è vero che i microorganismi sono in grado di copiare l'mRNA messaggero e di tradurlo a livello dei ribosomi, ma è anche vero che per fare ciò i microorganismi si avvalgono di enzimi o strutture cellulari sufficientemente diverse rispetto alle stesse strutture che vengono sfruttate dagli organismi superiori. Quello che vedremo è tutta una serie di farmaci che vanno ad inibire la biosintesi delle proteine.

Biosintesi delle proteine

La biosintesi delle proteine avviene sui ribosomi che sono organuli posseduti sia da organismi superiori che da cellule procariotiche. Tuttavia, i ribosomi sono diversi a seconda che siano di natura procariotica o eucariotica, infatti quelli eucariotici sono ribosomi 80s, quelli procariotici sono 70s. Negli eucarioti quello che succede è che quando vanno a tradurre il DNA in RNA messaggero, questo avviene attraverso due processi: una prima trascrizione che è un pre-RNA messaggero poi un processing che porta alla formazione di RNA messaggero che una volta processato, migra dal nucleo al citoplasma dove incontra i ribosomi che traducono l'mRNA in proteine corrispondenti.

Invece nella cellula procariota non c'è divisione tra il nucleo e il citoplasma e quindi la traduzione del RNA messaggero avviene sui ribosomi laddove l'RNA messaggero viene trascritto. Perciò è possibile sfruttare la differenza tra sintesi proteica procariotica da quella eucariotica per ottenere farmaci che siano selettivi sulla cellula procariotica. I ribosomi batterici sono più semplici rispetto a quelli eucariotici, li chiamiamo ribosomi 70S sulla base del loro coefficiente di sedimentazione e sono costituiti da una subunità minore 30S e una maggiore 50S, laddove invece le subunità degli eucarioti sono costituite da una subunità minore 40S e una maggiore 60S, quindi le subunità sono diverse.

Anche le specie di RNA ribosomiale che compongono queste subunità sono differenti per i batteri e per gli eucarioti. Quindi abbiamo una significativa differenza anche a livello morfologico del ribosoma batterico rispetto a quello eucariotico, e di conseguenza abbiamo la possibilità di utilizzare farmaci che possono utilizzare queste differenze e che quindi vanno a legare il ribosoma batterico piuttosto che quello eucariotico. Diversamente questi farmaci non potrebbero essere utilizzati perché se ha affinità identica sia per il ribosoma batterico come per il ribosoma umano, una volta somministrato non distingue una forma da un'altra e quindi bloccherebbe anche la sintesi proteica delle cellule umane e la tossicità sarebbe indicibile.

La traduzione del RNA messaggero in proteine avviene in 3 fasi

• Inizio
• Allungamento
• Terminazione

Inizio

L'RNA messaggero in direzione 5'-3' come avviene la sintesi di proteine, il primo a legare l'RNA messaggero è la subunità minore del ribosoma, una volta legato subentra la subunità maggiore per formare il complesso ribosomiale e l'RNA messaggero scorre all'interno. Una volta agganciato e quindi una volta avvenuto l'inizio della fase di traduzione avviene l'allungamento.

Allungamento

L'allungamento sfrutta tre siti che esistono nel ribosoma che sono il sito A, P ed E. Il sito P è quello dove si verifica l'allungamento della catena polipeptidica, il sito A invece è quello dove si va a legare l'RNA transfer (tRNA) corrispondente al codone che si trova nel sito A. Il sito E invece porta l'RNA transfer ormai scarico che deve essere rilasciato. Quindi il tRNA porta l'amminoacido corrispondente alla tripletta nel sito A, laddove nel sito P esiste la catena polipeptidica in allungamento, a questo punto abbiamo un legame tra l'amminoacido che si trova nel sito A e la catena nascente che si trova nel sito P. Nel momento in cui si verifica questo legame che è caratterizzato da una peptidiltransferasi, il ribosoma slitta di un tratto e la catena dal sito P si troverà nel sito A.

Fine

Mentre nel sito E verrà allocato il tRNA vuoto e sarà allontanato dal ribosoma e quindi il ribosoma scorre su tutto l'mRNA operando questa traduzione da acido nucleico a proteina e si avrà la biosintesi della catena.

Interazione antibiotici con subunità ribosomiali

Esistono diversi farmaci che sono in grado di intervenire in questa fase sintetica a diversi livelli. A seconda se i farmaci legano i ribosomi nella subunità minore o maggiore, abbiamo le tetracicline, la streptomicina e altri amminoglicosidi che legano la subunità 30S dei procarioti. Tuttavia, le tetracicline, se utilizzate a dosi elevate, possono legare anche le subunità minori del ribosoma eucariotico. La subunità 50S procariotico invece è target di cloramfenicolo, eritromicina, altri macrolidi e la lincomicina, mentre la subunità maggiore del ribosoma eucariotico viene targettata dal cicloesinide.

C'è una specificità nel senso che le tetracicline sono specifiche per le subunità 30S procarioti, solo se sovradosati possono interagire con le subunità minori 40S degli eucarioti.

Meccanismo d'azione generale

Ci sono vari step in cui gli antibatterici possono inibire il processo di traduzione. Come gli ossazolidinoni che si legano alla subunità 50S e non permettono di legarsi con la subunità 30S. Le tetracicline agiscono nella fase iniziale della sintesi proteica, inibendo il legame del tRNA al sito accettore. Il cloramfenicolo invece va a bloccare il trasferimento della catena peptidica dal sito A al sito P. Anche i macrolidi effettuano un blocco della traslocazione come gli amminoglicosidi.

Tetracicline

Come prima classe di farmaci attivi sulla sintesi proteica dei batteri abbiamo le Tetracicline. Sono antibiotici di origine naturale, sono stati isolati intorno al 1950 a partire da streptomiceti, e appartengono chimicamente alla classe naftacenica carbossamidica policiclica. Composto da un nucleo naftacenico, sono carbossamidi perché presentano una funzione carbossamidica in posizione 3 e policiclica perché è costituito da 4 cicli condensati che chiameremo ciclo A, B, C e D. Questi cicli sono ricchi di sostituenti, vedremo quali sono quelli farmacoforici, importanti per l'interazione con la subunità ribosomiale batterica 30S.

Le tetracicline agiscono con una tossicità abbastanza spiccata sul ribosoma batterico, però ad alte concentrazioni agiscono anche sui ribosomi eucariotici. Tuttavia poiché penetrano all'interno delle cellule batteriche attraverso un sistema di trasporto attivo, a livello delle cellule degli organismi superiori queste strutture deputate al trasporto attivo delle tetracicline non sono presenti e quindi possiamo considerare questi farmaci selettivi sul ribosoma batterico, perché non riescono a raggiungere la struttura analoga delle cellule superiori. Lo spettro d'azione è ampio dal momento che questi farmaci sono in grado di inibire la sintesi proteica di numerosissimi microorganismi dai Gram- ai Gram+ agli actinomiceti e altre specie come vibrione del cholerae, mycoplasma pneumoniae e molti altri.

Proprietà chimiche

Tuttavia ciò che contraddistingue le tetracicline è il fatto che la loro interazione con il ribosoma in corrispondenza del nucleotide numero 892 avviene con una costante di dissociazione abbastanza elevata, questo significa che la loro interazione con il ribosoma non è molto stabile, infatti il legame si dissocia facilmente il che rende queste molecole batteriostatiche, piuttosto che battericide.

Vediamo ora le caratteristiche strutturali. Le tetracicline sono anfotere cioè possono sia protonarsi che deprotonarsi e presentano 3 diversi gruppi di dissociazione. Il primo è la funzione amminica terziaria (dimetilammina) che può protonarsi ovviamente a pH basici, poi abbiamo la regione β-idrossicarbonilica con doppio legame che anch'essa è particolarmente acida, anche l'altra regione il sistema trionico è molto acida, acidità paragonabile all'acido acetico. Si tratta di solidi cristallini gialli, poco solubili in acqua, le funzioni acide formano facilmente chelati metallici perché questi gruppi ossidrilici e gli O carbonilici sono dotati di funzione chelante, quindi capaci di chelare cationi come il Ca²⁺, Al²⁺, Mg²⁺ e spiegano anche alcune proprietà farmacocinetiche di questa classe di farmaci. La loro colorazione è dovuta alla coniugazione dei doppi legami del sistema 1,3-dicarbonilico (11, 11a, 12), la funzione basica invece è data dal gruppo dimetilamminico in posizione 4. Il sistema fenolo-enone che si estende dal C10 al C12 presenta un pKa=7,5 mentre il sistema trionico coniugato (anello A) che va dal C1 al C3 è responsabile del carattere acido con un pKa=3 acido come l'acido acetico. Quindi questi sono i gruppi acidi e basici presenti all'interno delle tetracicline. Queste molecole vengono somministrate solo per via orale dal momento che non sono solubili in acqua, e quindi non è possibile preparare soluzioni iniettabili in acqua.

• Chelazione

Le funzioni acide delle tetracicline sono in grado di formare sali per chelazione con ioni metallici. Chelano metalli come Ca²⁺ e Mg²⁺, il che significa che questo farmaco si accumula in tessuti ricchi di Ca²⁺ e Mg²⁺ tipo le ossa e i denti. Ma si è visto che si accumulano anche a livello epatico, e a livello della milza. Queste molecole non vanno somministrate contemporaneamente al latte o ai derivati minerali poiché in grado di chelare il calcio e molti cationi, e di conseguenza la formazione di questi chelati limiterebbe enormemente l'assorbimento intestinale di questi farmaci.

Inoltre, sempre per questa loro proprietà chelante le tetracicline sono vietate in età pediatrica, in quanto il tessuto osseo nei bambini è in via di accrescimento e le tetracicline potrebbero deporsi all'interno del tessuto osseo grazie alla loro capacità di chelare il calcio e interferire con il processo di accrescimento. Anche nei denti si depone formando dei chelati giallastri che sono irreversibili.

La funzione carbonilica è quella responsabile della chelazione con in alfa l'enolo che è in grado di cedere elettroni alla specie metallica, quindi povera di elettroni per formare questi complessi che sono molto stabili. Guardando il grafico e vedendo l'assunzione delle tetracicline a stomaco vuoto, il picco della concentrazione plasmatica delle tetracicline si ha a 2, mentre se viene assunto il farmaco e contemporaneamente anche il latte o con l'antiacido la concentrazione plasmatica resta molto bassa quasi nulla, il che significa che non avremo assorbimento, questo perché si formano chelati con il Ca²⁺ contenuto nel latte o con Al³⁺ contenuto nell'antiacido.

• Epimerizzazione

Per le tetracicline è molto importante la stereochimica di questo gruppo sostituente in posizione 4 cioè del gruppo amminico. Questa stereochimica però è abbastanza instabile dal momento che in ambiente basico, il protone può essere estratto dalla base cosicché la molecola aromatizza si forma il doppio legame e nel momento in cui il protone viene addizionato nuovamente può entrare sia da una faccia che dall'altra della molecola generando se entra davanti la tetraciclina, se entra dalla parte posteriore forma la 4-epitetraciclina che presenta una stereochimica invertita rispetto alla tetraciclina.

Meccanismo: eliminazione del protone in ambiente basico, formazione del doppio legame e nel momento in cui il protone penetra nuovamente all'interno della molecola, questo può penetrare sia dalla parte posteriore formando un derivato inattivo il 4-epitetraciclina con stereochimica invertita in posizione 4, o davanti formando nuovamente la tetraciclina. Questa reazione è abbastanza spontanea tanto è vero che le compresse di tetraciclina vengono sovradosate, significa che viene inserita all'interno della forma farmaceutica una quantità di principio attivo che è di circa il 15% in più rispetto a quello necessario per avere l'azione antibatterica e questo va in parte a garantire una perdita di farmaco dovuta all'epimerizzazione in posizione 4 che determina la formazione di un enantiomero inattivo della tetraciclina.

• Disidratazione

Avviene in corrispondenza del C6. Questa disidratazione può essere catalizzata dall'ambiente acido e deriva dalla funzione iniziale dell'OH in posizione 6 e successivamente la fuoriuscita del gruppo H₂O⁺ e dell'H in posizione C5a, che porta alla formazione di un doppio legame e la reazione è abbastanza favorita, il prodotto che si forma non è totalmente inattivo, però presenta un'attività più bassa rispetto a quella della tetraciclina.

• Sensibilità alla luce

Quando le tetracicline vengono esposte alla luce UV, soprattutto quelle che presentano il Cl come la clorotetraciclina, possono determinare la formazione di radicali liberi.

Ambiente basico

In ambiente basico a pH superiori a 8.5 quello che succede è l'apertura dell'anello C in conformazione di un lattone inattivo, questa reazione catalizzata dall'ambiente basico porta alla perdita dell'H della funzione alcolica in posizione C6 e successivo attacco di questo O sul carbonile presente sullo stesso anello. Questo porta alla formazione di un lattone che può ulteriormente evolvere attraverso la formazione di questo anello lattonico che però è slegato dall'anello B. Questa struttura è inattiva ed è una reazione collaterale che si verifica a pH superiori a 8.5. Quindi sono molecole instabili dal punto di vista chimico. Sia in ambiente acido che in ambiente basico possono dare reazioni di disidratazione, di formazione dei radicali liberi, apertura degli anelli epimerizzazioni che portano alla perdita di attività.

Queste molecole vengono somministrate solo per via orale, perché tutte queste reazioni in ambiente acquoso sono particolarmente favorite e quindi risulta complicato preparare delle formulazioni somministrate per via parenterale.

Meccanismo d'azione

La loro azione antibatterica è dovuta al blocco della sintesi proteica nella fase iniziale. Le tetracicline si legano alla subunità ribosomiale 30S, in particolar modo al nucleotide numero 892. Questo legame provoca una variazione conformazionale nella subunità 30S in particolar modo nel sito accettore A, laddove va a legare tRNA. Questo cambio conformazione, quindi questa distorsione altro non fa che rendere al tRNA difficile il riconoscimento con il suo sito corrispondente e quindi viene interrotta la sintesi proteica. Tuttavia abbiamo definito le tetracicline farmaci batteriostatici e questo è dovuto al fatto che l'interazione che stabilisce con il nucleotide 892 non è stabile. È un'interazione caratterizzata da una costante di dissociazione piuttosto elevata, quindi il farmaco così come si lega potrebbe distaccarsi dalla subunità ribosomiale il che rende l'inibizione non drastica ma reversibile e il meccanismo delle tetracicline batteriostatico. I gruppi funzionali farmacoforici implicati con il legame RNA ribosomiale sono in particolar modo 1-10-11 e 12. In realtà la funzione dimetilamminica non sembra essere implicata in nessun legame.

Osservando i gruppi funzionali delle tetracicline quello che si può capire è anche che tipo di interazione si viene a stabilire con il ribosoma trattandosi fondamentalmente di gruppi ossidrilici e carbonilici siamo certi che le interazioni che si formano sono a H, interazioni che non sono particolarmente forti dal punto di vista energetico il che giustifica la costante di dissociazione elevata del legame tetracicline-ribosoma.

Nelle penicilline il primo legame che si instaura con il farmaco è quello ionico, il più forte, e qua non ci sono legami ionici ma solo H che non sono forti e determinano perciò un inibizione reversibile. Ad alte dosi le tetracicline come abbiamo già detto possono legarsi anche alle subunità ribosomiali minori eucariotiche 50S. Tuttavia, il motivo per cui le tetracicline sono considerate antibiotici selettivi nei confronti delle cellule batteriche è dovuto al fatto che le cellule eucariotiche sono prive di sistemi deputati al trasporto attivo in grado di veicolare il farmaco all'interno, mentre i sistemi di trasporto attivo sono presenti a livello dei Gram+, laddove invece la penetrazione all'interno dei Gram- avviene attraverso le porine.

SAR: Relazione struttura attività

Le tetracicline sono costituite da un nucleo di base lineare tetraciclico fuso (A, B, C e D) con diversi gruppi funzionali quali idrossiliche e carboniliche attaccate. I punti di variabilità sono le posizioni R1 R2 R3 ed R4, in realtà queste posizioni non sono direttamente coinvolte nel legame con la struttura recettoriale, la parte superiore della molecola non interviene in nessun legame ribosomiale 16s, in realtà la sostituzione su R1 R2 R3 ed R4 va più che altro a influenzare lo spettro d’azione.