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ANATOMIA PATOLOGICA

SOMMARIO: Definizione e cenni storici; Funzione del servizio di anatomica

patologica; Ciclo lavorativo nel laboratorio di anatomia patologica.

DEFINIAMO COS’E’ L’ANATOMIA PATOLOGICA:

“Branca specialistica della medicina che studia le malattie umane mediante esame

macroscopico degli organi e microscopico di cellule e tessuti. In ambito clinico

l’anatomia patologica svolge un ruolo fondamentale per la pianificazione di

eventuali terapie mediche o chirurgiche fornendo diagnosi su tessuti o cellule

prelevate da pazienti in cui si sospetta una malattia. L’indagine anatomopatologica

permette di distinguere tra tessuti normali, infiammazione, tumori benigni e maligni

ed altre condizioni patologiche.

Praticamente ogni organo o tessuto umano che sia stato prelevato durante un

intervento chirurgico viene sottoposto ad indagine anatomopatologica”.

Storicamente parlando, possiamo far iniziare la storia dell’anatomia patologica

citando le dissezioni anatomiche eseguite già nell’antica Grecia dai medici Erofilo

di Calcedone ed Erasistrato di Chios all’inizio del III secolo a. C. ma il fondatore

dell’anatomia patologica è considerato Giovanni Battista Morgagni. Questi si

concentrò sulla correlazione tra osservazioni anatomiche e sintomi clinici facendo

sì che per la prima volta le autopsie contribuissero significativamente alla

comprensione delle malattie nella scienza medica, Morgagni comprese che le

discipline cliniche traggono beneficio dall’osservazione anatomica e scrisse il primo

testo di anatomia patologica macroscopica.

Nel 1905, Wilson alla Mayo Clinic pubblicò un metodo per l’esame intraoperatorio

su sezioni criostatiche usando un microtomo congelatore, nei successivi 100 anni

le metodiche istochimiche, immunoistochimiche, ultrastrutturali e molecolari hanno

contribuito al rapido sviluppo dell’anatomia patologica che pratichiamo

quotidianamente nei nostri laboratori ed ospedali. Il patologo svolge un ruolo

diagnostico importante ed in contesto multidisciplinare: clinico/chirurgico, patologo,

radiologo, endoscopista.

La diagnostica anatomo patologica consiste di un procedimento complesso che

richiede l’acquisizione di informazioni clinico anamnestiche, interpretazione ed

integrazione di dati, formulazione di un giudizio diagnostico.

La diagnosi di laboratorio è solo la fase finale di un processo di trasformazione del

campione biologico che avviene per stadi che richiedono l’interazione di chimica,

tecnologica-informatica e competenze tecniche. Le fasi di allestimento dei campioni

sono altrettanto importanti e complesse dell’attività diagnostica

dell’anatomopatologo e vedono la centralità del tecnico di laboratorio di

anatomia patologica.

Il procedimento diagnostico è sotto l’influenza di due fattori:

1. FATTORI SOGGETTIVI:

1. Formazione culturale;

2. Aggiornamento;

3. Esperienza.

2. FATTORI OGGETTIVI E SEMIOGGETTIVI:

1. Morfologica (macro e microscopica);

2. Indagini istochimiche;

3. Indagini immunoistochimiche;

4. Indagini molecolari.

Si è arrivati all’ottimizzazione diagnostica grazie alla standardizzazione delle

procedure, criteri interpretativi semplici e riproducibili, centralizzazione e

controllo e verifica della qualità di laboratorio.

COSA PUO’ FACILITARE LA STANDARDIZZAZIONE?

1. La definizione di linee guida e protocolli tecnico-operativi;

2. L’ottimizzazione delle metodiche in funzione all’obiettivo diagnostico;

3. La limitazione nel ricordo a tecniche personalizzate;

4. L’automatizzazione delle procedure.

COSA PUO’ OSTACOLARE LA STANDARDIZZAZIONE?

1. Le difficoltà tecniche legate a fattori logistici e a disponibilità di

strumentazione;

2. Il materiale diagnostico sub-ottimale (quantitativamente e qualitativamente);

3. Le esigenze diagnostiche differenziate in senso specialistico;

4. L’estrema varietà di protocolli operativi talora basati su esperienze personali.

CICLO LAVORATIVO DEL LABORATORIO DI ANATOMIA

PATOLOGICA

1. INVIO DEL MATERIALE.

La corretta gestione del materiale è fondamentale per la conservazione ottimale del

dettaglio cito-morfologico; l’efficace applicazione delle tecniche diagnostiche e

ancillari (immunoistochimica, biologia molecolare, etc.) e l’identificazione del

materiale in tutte le fasi di lavoro.

Ci sono due tipi di materiali: campioni istologici (pezzo operatorio o biopsia

escissionale chirurgica, biopsia endoscopica…) e campioni citologici (cellule in

sospensione in fluidi biologici o di conservazione come urine o espettorato, strisci o

prelievi da agoaspirazione raccolti su supporto).

I campioni (fissati od a fresco) devono pervenire in contenitori di plastica chiusi, a

tenuta, proporzionati alle dimensioni del campione, recanti un’etichetta non

cancellabile sulla quale siano chiaramente leggibili le generalità del paziente ed il

reparto di provenienza. I campioni infetti (HIV, HCV) devono pervenire in

contenitore doppio contrassegnato in modo da evidenziare chiaramente la

pericolosità del contenuto. È necessario inoltre che il materiale venga sempre

accompagnato da una scheda informativa clinico-anamnestica/modulo di richiesta.

Ogni campione è corredato da una scheda di accompagnamento contenente le

informazioni anagrafiche del paziente tali da renderlo immediatamente

identificabile.

I pezzi operatori e i campioni bioptici devono pervenire in anatomia patologica:

 A FRESCO: entro e non oltre 30’ dal prelievo, ad es. per esami intraoperatori

o necessità di prelievi per estrazione di acidi nucleici;

 IN FISSATIVO: nell’arco di 24h.

I campioni citologici devono pervenire:

 IN FISSATIVO: (rapporto liquido/fissativo ½);

 Se “strisci” devono essere fisasti in alcol o fissativo spray per citologia

(citofix).

Per una buona conservazione dei campioni è essenziale seguire delle norme

generali come: fissare rapidamente il campione limitando così i fenomeni

autolitici; ridurre l’imbrattamento del campione (da sangue e/o detriti necrotico-

purulenti) con lavaggio in soluzione fisiologica; il fissativo deve essere in

quantità corrispondente ad almeno cinque volte il volume del campione.

Durante l’invio del materiale in laboratorio, è essenziale evitare: trasporto del

materiale mediante supporti inadeguati con rischio di disidratazione; lasciare

essiccare il campione prima dell’immersione in fissativo; l’immersione del

campione in soluzione fisiologica con possibili alterazioni tissutali e il contatto

diretto del campione con ghiaccio secco e refrigeranti vari.

SCOPO DELLA FISSAZIONE è di bloccare i processi autolitici e degenerativi di

tessuti e cellule; preparare i tessuti alle successive fasi della processazione. I

processi degenerativi tissutali hanno inizio quando si interrompe l’ossigenazione

dei tessuti.

DECOMPOSIZIONE: processo di disfacimento delle cellule e tessuti causata

principalmente da due fattori:

1. AUTOLISI: necrosi per “autodigestione” delle cellule, da enzimi presenti nei

tessuti (lisosomi macrofagici), senza ossigeno e senza intervento dei

batteri. La velocità del processo dipende dalla massa, del tipo di tessuto, da

temperatura e umidità ambientali.

2. PUTREFAZIONE: decomposizione delle proteine dovute all’azione di

microrganismi (aerobi ed anaerobi).

Il metodo di conservazione più semplice è il raffreddamento.

UN BUON FISSATIVO DEVE:

1. Prevenire la decomposizione di cellule e tessuti;

2. Conservare la morfologia delle cellule e dei tessuti, preservando il tessuto

dal danno osmotico e dalla coartazione limitando, ad ogni livello di indagine,

le alterazioni morfologiche;

3. Conservare le molecole significative: mantenere in situ tutti i componenti

tissutali, preservare tutte le reattività chimiche originali, stabilendo legami fra

proteine, lipidi ed altri costituenti cellulari senza distruggere gruppi funzionali

dei diversi tipi di molecola;

4. Essere facilmente reperibile; avere tossicità limitata, basso costo, buone

caratteristiche di penetrazione nei tessuti.

I fissativi sono suddivisi in base al meccanismo d’azione, in due categorie principali:

1. FISSATIVI COAGULANTI (metanolo, etanolo, acido picrico): alterano la

costante dielettrica delle proteine determinandone la precipitazione;

sostituiscono le molecole di acqua tissutali causando la rottura dei ponti

idrogeno responsabili delle strutture proteiche di secondo e terzo livello.

2. FISSANTI COMPLESSANTI (formaldeide, glutaraldeide): le molecole di

fissativo si inseriscono formando legami complessi tra le catene proteiche

adiacenti; vengono stabiliti legami di cross-link tra gruppi aminici, iminici,

guanidilici, idrossile, carbonile ed anelli aromatici degli aminoacidi.

FISSATIVI COAGULANTI

 VANTAGGI: non formano legami covalenti con le strutture aminoacidiche;

non determinano modificazioni nelle strutture proteiche di primo e secondo

livello; la buona conservazione delle strutture proteiche spiega la buona

conservazione di molti epitopi antigenici;

 SVANTAGGI: alterano la struttura terziaria delle proteine; estraggono molte

sostanze a basso peso molecolare; provocano una considerevole

frammentazione dei tessuti con frequente dislocazione degli antigeni;

penetrano lentamente nel tessuto.

FISSATIVI COMPLESSANTI:

 VANTAGGI: Preservano la morfologia tissutale in modo più efficace dei

fissativi coagulanti; limitano gli artefatti causati dalla dislocazione delle

strutture antigeniche;

 SVANTAGGI: determinano consistenti alterazioni a tutti i livelli strutturali delle

proteine; modificano varie strutture antigeniche soprattutto di membrana con

fenomeni di mascheramento antigenico e frammentano le catene di acidi

nucleici (DNA e RNA).

Non esiste ancora un fissativo ideale che risponda a tutte le esigenze. Tutti i

fissativi, con grado ed intensità variabile, determinano la comparsa di artefatti e

alterazioni di strutture. La scelta del fissativo è frutto di un compromesso che valuti

accuratamente fattori come il tipo di tessuto e natura della sostanza da preservare,

procedura diagnostica prescelta, costo, reperibilità e grado di tossicità del fissativo.

IL FISSATIVO CHE MEGLIO DI ADATTA ALLE ESIGENZE MEDIE DI UN

LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA E’ LA FORMALINA.

La formalina ha una soluzione acquosa del 37-40% di formaldeide o aldeide

formica (composto solido ad alto peso molecolare). Una molecola di formaldeide si

intercala tra due molecole proteiche creando un ponte metilenico (-CH2-).

FORMALINA:

 VANTAGGI: costituisce un buon compromesso tra conservazione del

dettaglio citomorfologico-architetturale e conservazione dell’antigenicità

(sufficiente ma non ottimale); buona capacità di penetrazione nei tessuti;

facile reperibilità e basso costo e inoltre permette la conservazione dei

campioni immersi per tempi lunghissimi.

 SVANTAGGI: riduzione dimensionale del tessuto durante la fissazione;

deposizione di pigmento (ematina) per combinazione l’emoglobina, evitabile

con pH neutro, scarsa fissazione nucleare, agisce con lentezza e frammenta

DNA e RNA.

FORMALINA: RISCHIO TOSSICO – Potenzialmente letale se ingerita, provoca

irritazione alla cute, agli occhi e alle vie respiratorie, può dare allergia, causare

cecità e ha una sospetta azione cancerogena.

È utile ricordare di adottare tutte le precauzioni possibili, come l’usare una cappa

aspirante, proteggersi con guanti, occhiali, maschere a filtro di carbone, lavare

immediatamente con acqua corrente le parti venute a contatto, limitare

l’esposizione e rivolgersi al medico se ingerita. La formalina inoltre può essere

impiegata in altri modi come per la produzione di resine e adesivi impiegati

nell’industria tessile, automobilista, edilizia, può essere usata come disinfettante,

nella falegnameria, per la produzione di vernici.

La fissazione dei tessuti può portare anche effetti indesiderati, come la coartazione

e l’indurimento che dipende dalla disidratazione delle proteine ed è più grave con

l’alcol che con la formalina oppure la distorsione e la deformazione tissutale

talora fino alla lacerazione, ciò dipende dalla diversa risposta delle diverse

componenti degli organi in funzione del loro variabile contenuto di acqua e proteine.

ACCETTAZIONE –

 SCOPO: registrare in maniera permanente l’accesso del campione;

 METODO: attribuzione di un numero di registrazione progressivo al

campione;

 STRUMENTI USATI: software gestionale per inserire/recuperare i dati

anagrafici del paziente e i dati relativi all’esame (reparto, tipologia, sede,

curante etc.);

 PERSONALE: tecnico e/o amministrativo. Il medico funge da supervisore.

ACCETTAZIONE IN PRATICA –

1. CONTROLLO DI OGNI CAMPIONE: integrità, presenza di fissativo,

presenza del campione, dell’etichetta, del modulo di richiesta, verificare la

corrispondenza dei dati tra modulo e contenitore, verifica della distinta di

accompagnamento dei campioni del reparto e validazione;

2. REGISTRARE DELL’ESAME NEL SISTEMA INFORMATICO;

3. ATTRIBUZIONE DEL NUMERO PROGRESSIVO;

4. STAMPA DELLE ETICHETTE CON IL NUMERO;

5. ETICHETTATURA DI CONTENITORI E MODULO DI RICHIESTA;

ACCETTAZIONE: CRITICITA’ – Le criticità dell’accettazione sono date dal

trascurare le non conformità dei campioni o dei moduli, lo scambio di campioni tra

pazienti diversi. Per prevenire ciò è utile prestare la massima attenzione, fare

doppia e tripla verifica, gestire un caso alla volta e l’automazione dell’accettazione

interfacciando i software delle sale operatorie a quello dell’AP.

ACCETTAZIONE: RISCHIO PER L’OPERATORE – L’operatore presenta diversi

tipi di rischio, uno fra tanti è il rischio chimico dovuto ai vapori di formalina, il rischio

biologico a causa dei campioni inviati a fresco. Per prevenire i rischi, ogni campione

deve essere considerato come potenzialmente infetto e maneggiato utilizzando

tutte le cautele e i presidi di protezione individuale necessari.

CAMPIONAMENTO O RIDUZIONE –

 SCOPO: preparare i campioni destinati all’allestimento dei preparati

istologici;

 METODO: osservazione ed eventuale taglio dei campioni bioptici ed

operatori registrati;

 STRUMENTI: cappe aspiranti, pinze, bisturi e coltelli, contenitori per i prelievi

e pennarelli indelebili;

 PERSONALE: medico e tecnico.

LE CAPPE BIOLOGICHE – le cappe biologiche agiscono come barriere per

minimizzare il rischio di infezioni e di contaminazione da sostanze tossiche

impedendo la fuoriuscita di aerosol nell’ambiente e la loro inalazione da parte degli

operatori. Esistono diversi tipi di cappe con livelli di sicurezza diversi. In Anatomia

Patologica si usano cappe di classe II che proteggono sia l’operatore che

l’ambiente dalle sostanze tossiche e dai microrganismi. Sotto cappa si procede alla

descrizione macroscopica e alla misurazione del campione, la descrizione viene

registrata a seconda della disponibilità dei laboratori.

Il patologo procede al campionamento secondo protocolli prestabiliti e linee guida, i

campioni vengono depositati nelle BIOCASSETTE opportunamente

contrassegnate.

BIOCASSETTE – Le biocassette sono contenitori di plastica di colori diversi con

chiusura a scatto. Sono resistenti a tutti i passaggi delle processazione e

possiedono spazi destinati alla scrittura dei codici identificativi. È importante

ricordare che i codici devono essere scritti e stampati con inchiostro indelebile e

resistente ai solventi. Le biocassette inoltre stabiliscono le dimensioni massime dei

campioni. Per la scrittura del codice identificativo ci sono vari livelli possibili di

automazione: scrittura a mano, stampigliatrice indipendente e l’uso di un sistema

integrato gestito dal software di registrazione dei campioni.

CAMPIONI CONTENENTI ELEVATE QUANTITA’ DI CALCIO COME LE OSSA –

Per questi campioni vengono usate sostanze che rimuovono gli ioni calcio dal

tessuto come chelanti e acidi. La decalcificazione richiede tempo, in funzione delle

dimensioni del campione. Le sostanze decalcificanti alterano gravemente la

morfologia e l’antigenicità delle cellule: se possibile, è meglio fare un prelievo dei

tessuti molli prima della decalcificazione.

CAMPIONAMENTO: GESTIONE DEI MARGINI – In molti casi il patologo deve dire

al clinico se la lesione è stata asportata in modo radicale – valutazione dei margini

chirurgici del campione. Per essere sicuri di vedere i margini sul vetrino si devono

colorare con coloranti resistenti alle successive fasi della processazione. I

margini vengono colorati con inchiostro di China che viene fissato con Bouin

(fissativo a base di acido picrico) diventando resistente alla formalina.

Per il campionamento, il personale necessario è il medico che esegue la

descrizione ed i prelievi dei campioni che necessitano taglio, il tecnico che gestisce

in maniera indipendente i campioni bioptici di piccole dimensioni che vengono

includi in toto senza modifiche e il tecnico che coadiuva il medico campionatore,

trascrive le descrizioni dei campioni, prepara le biocassette e legge le informazioni

cliniche.

Al campionamento, le informazioni da registrare sono il numero di biocassette

allestite per ogni campione, contenuto di ogni biocassetta e numero e dimensione

dei prelievi bioptici presenti.

CAMPIONAMENTO: RISCHI PER L’OPERATORE – Durante il campionamento i

rischi sono molteplici, si incorre al rischio chimico da vapori di formalina, al rischio

chimico da schizzi di formalina, ferita da taglio e il rischio biologico da inoculazione

secondaria a taglio più grave per campioni inviati a fresco che per campioni fissati.

I DPI AL CAMPIONAMENTO – Protezione delle mani con guanti NON sterili,

guanti in maglia antitaglio ove neces