Anatomia patologica

Tipi di campioni in anatomia patologica

L'anatomia patologica è una branca specialistica della medicina che studia le malattie umane mediante esame macroscopico di organi (autopsia, pezzi operatori e biopsie ambulatoriali) o microscopico dei tessuti e delle cellule (istologico, citologico, istochimico, immunoistochimico e di biologia molecolare), avvalendosi della conoscenza e delle tecniche provenienti da altre discipline: anatomia, istologia, microbiologia, immunologia, genetica, biologia molecolare.

• L’anatomia patologica studia le alterazioni strutturali e funzionali prodotte dagli eventi patologici o dagli errori congeniti, vale a dire la malattia.

La professione

L’anatomo patologo è lo specialista medico-clinico deputato alla diagnosi di malattie su cellule e tessuti. Il ruolo dell’anatomo patologo è centrale nel percorso diagnostico terapeutico in quanto finalizza con un atto medico, cioè la diagnosi, una sequenza di procedure di tipo tecnico cognitivo deputate all’esame di organi o campioni di organi (cellule e/o tessuti). La diagnosi anatomo patologica, che va integrata con il quadro clinico del paziente, è quindi il risultato della interpretazione da parte del medico anatomo patologo delle caratteristiche morfologiche (macroscopiche, microscopiche) eventualmente integrate dall’analisi di specifiche caratteristiche molecolari, del campione biologico in esame.

L’attività diagnostica dell’anatomo patologo si esplica in tutti i campi della patologia:

• In campo oncologico definisce la natura della lesione, identifica fattori prognostici e predittivi di risposta terapeutica, utilizzando tecniche di immunofenotipizzazione e molecolari, e fornisce di conseguenza gli elementi fondamentali e indispensabili per una scelta terapeutica mirata.
• Nell’ambito della prevenzione oncologica il patologo è il medico responsabile della diagnostica cito-istologica dei programmi di screening e produce una diagnosi che condiziona i successivi comportamenti clinico-terapeutici.
• Nell’ambito dei trapianti d’organo il patologo ha un ruolo nella valutazione della idoneità dell’organo e successivamente monitorizza l’eventuale patologia da rigetto e patologie associate.
• Nell’ambito delle patologie infettive, il patologo, attraverso la morfologia e tecniche di immunofenotipizzazione e molecolari, contribuisce alla identificazione degli agenti patogeni, segnatamente nelle infezioni opportunistiche in soggetti immunodepressi.

Il patologo interviene nella definizione diagnostica di un’ampia gamma di patologie degenerative, dismetaboliche, immunitarie, malformative e infiammatorie e nell’identificazione e caratterizzazione delle cosiddette “malattie rare”. L’attività diagnostica svolta nel servizio di anatomia patologica si esplica attraverso l’emissione di un referto che verrà comunicato al richiedente (clinico o paziente) tramite un atto scritto e firmato dal medico anatomo patologo.

Approfondimento

L'immunofenotipizzazione è un esame volto ad identificare le cellule a seconda del tipo di antigeni o marcatori sulla superficie cellulare. Il test di immunofenotipizzazione viene effettuato per diagnosticare determinati tipi di leucemie e linfomi. Può essere eseguita su cellule del sangue e sul midollo osseo. I valori di immunofenotipizzazione si ottengono confrontando le cellule tumorali con cellule normali del sistema immunitario.

Referti di anatomia patologica

I referti di anatomia patologica devono riportare i dati essenziali per l’identificazione del paziente (nome, cognome, data di nascita), il tipo di campione ecc. I referti anatomopatologici racchiudono 5 principali obiettivi:

• Descrizione delle patologie osservate ad occhio nudo (esame macroscopico) e al microscopio; descrizione delle lesioni patologiche dei vari organi, tessuti e apparati, contribuendo all’inquadramento nosologico delle malattie.
• Istopatogenesi; permette di ricostruire sul piano morfologico (macroscopico e microscopico) l’iter di una patologia dalla fase iniziale (genesi) alla fase evoluta o conclamata, fino a quella terminale reversibile o irreversibile.
• Diagnosi, cioè l’accertamento morfologico di una malattia. Questa può essere:
  • Completa (neoplastica o non, istogeneticamente tipizzata, graduata e stadiata)
  • Compatibile (se riferibile prevalentemente ad una patologia senza escluderne altre)
  • Suggestiva (attribuibile ad una patologia non altrimenti definibile)
  • Tardiva (riscontro autoptico e documentazione istopatologica)
  • Di controllo (follow-up per seguire l’andamento di una malattia)
  • Precoce (analisi citologica preventiva ed istologica delle malattie in fase iniziale)
• Prognosi; sul piano morfologico si attua attraverso la previsione del decorso di una malattia in base all’istotipo, grado istologico e stadio.
• Predizione di risposta alla terapia; ad esempio nel cancro della mammella (e recentemente anche dello stomaco) il riscontro di amplificazione del gene HER2-neu, individuato mediante analisi immunoistochimica e/o mediante FISH, può portare cambiamenti nella terapia del cancro; nel cancro del colon la presenza di mutazione di KRAS esclude la possibilità di trattamento con Cetuximab (farmaco anti-EGFR) negli stadi avanzati.

Flusso di lavoro in anatomia patologica

Il medico che effettua il prelievo:

• Effettua la biopsia sul paziente
• Pone la biopsia in un contenitore con formalina al 10%
• Etichetta il contenitore con le generalità del paziente
• Compila un modulo di richiesta esame

Il tecnico/infermiere di anatomia patologica che accetta il prelievo:

• Verifica che il materiale inviato sia in formalina e corrisponda a quello descritto nella richiesta
• Verifica che il modulo di richiesta sia stato compilato in ogni sua parte
• Assegna al caso un numero di protocollo

L’anatomopatologo:

• Descrive il materiale che ha ricevuto in esame
• Effettua uno o più prelievi di tessuto non più grandi di 1-2 cm da cui allestire i preparati istologici
• Pone i prelievi in biocassette di plastica

Il tecnico di anatomia patologica che allestisce i preparati istologici:

• Pone le biocassette nel processore dei tessuti
• Include il tessuto processato in un blocchetto di paraffina
• Taglia, colora e monta le sezioni su un vetrino
• Consegna i vetrini all’anatomopatologo

L’anatomopatologo:

• Esamina i preparati istologici al microscopio
• Formula la diagnosi
• Scrive il referto
• Invia il referto al medico che ha effettuato il prelievo

Campioni

• Pezzo autoptico
• Materiale bioptico (istologia):
  • Organi interi (da chirurgia)
  • Biopsia incisionale (parte della lesione)
  • Biopsia escissionale (tutta la lesione)
  • Agobiopsia
• Citologia: Esfoliativa (con possibili brushing o washing): PAP-test, citologia urinaria, espettorato
• FNA: citologia per agoaspirato
• Materiale criostato: da estemporanea
  • Autopsia: a scopo clinico, ha lo scopo di definire la causa di morte, chiarire quesiti clinico-scientifici.
  • Autopsia medico-legale: ha scopo di chiarire la natura della morte in casi in cui vi siano implicazioni penali e civili.

Tecniche di prelievo principali

Biopsia escissionale: è da preferire, se possibile. È la rimozione di tutta la lesione sospetta, rispettando i margini. Si utilizza generalmente per lesioni cutanee (in altre sedi, infatti, richiede un intervento chirurgico più invasivo)

Biopsia incisionale: si usa solo in rari casi, in genere quando la biopsia escissionale sarebbe troppo invasiva, in vista di un intervento conservativo (ad esempio, per un melanoma subungueale)

Agobiopsia: utilizza un ago spesso e preleva un frustolo di tessuto, consente un’analisi istologica ma limitata (anche dalla frequente necessità di agobiopsie multiple). Vengono eseguite a mano libera o sotto guida ecografica o TAC. Vengono ottenuti piccoli frammenti di tessuto da inviare al patologo. Solitamente riguardano organi profondi (fegato, rene, prostata).

Materiale bioptico (istologia): Organi interi (da chirurgia) Tessuti o organi (interi o in parte) asportati in seguito ad intervento chirurgico. Esaminando il pezzo operatorio il patologo si esprime sulla natura della patologia ma anche sulla completezza dell’intervento chirurgico. Es. resezione intestinale per tumore: valutazione dei margini di resezione, livello di infiltrazione della neoplasia, mappatura dei linfonodi etc. Reperti chirurgici Es: asportazione di utero, retto e vescica per carcinoma della cervice uterina localmente avanzato.

Esame istologico estemporaneo (diagnostica intraoperatoria)

L'esame istologico intraoperatorio (estemporanea al microtomo congelatore/criostato) è una tecnica diagnostica di anatomia patologica che può essere utilizzata durante un intervento chirurgico. Tecnicamente consiste in una biopsia in cui prelievo e diagnosi avvengono durante l'intervento chirurgico. Al fine di garantire tempi di lavorazione estremamente brevi, la biopsia viene congelata all'interno di un particolare strumento denominato criostato all'interno del quale il campione viene posto con un particolare gel (OCT) su di un supporto speciale e quindi esposto a temperature molto basse (-35°). In questo modo la biopsia è in grado di congelarsi in pochi minuti ed essere pronta al taglio da parte del tecnico di laboratorio, il quale otterrà delle fette spesse pochi micron da far aderire su di un vetrino porta oggetto. In seguito il vetrino così allestito verrà colorato con sostanze coloranti specifiche per i tessuti (colorazione con ematossilina-eosina) ed una volta montato sarà pronto per la lettura al microscopio.

L'esame intraoperatorio può venire richiesto al fine di chiarire la diagnosi di malattia, nel caso questa non sia già stata posta in precedenza, o quando durante l'operazione emergano nuovi quesiti diagnostici. Dall'esame in estemporanea dipende frequentemente il successivo procedere operativo. Il Tempo medio di allestimento di un esame intraoperatorio è di 10-15 minuti dall'arrivo del tessuto nel laboratorio e comunque nel minor tempo possibile. Indicazioni: conferma della natura benigna o maligna di una neoplasia. Nel caso di neoplasie maligne l’intervento è più esteso e interessa anche il tessuto sano circostante.

Microtomo – Criostato modalità di esecuzione

• Il frammento di tessuto viene inviato fresco al laboratorio.
• L’anatomo patologo esamina il materiale ricevuto ed esegue uno o più prelievi in quelle aree.
• Il tecnico congela il frammento di tessuto prelevato, lo taglia con il criostato e colora la sezione istologica con ematossilina eosina.
• L’anatomo patologo esamina la sezione al microscopio formula la diagnosi e la comunica in sala operatoria.

Campioni citologici – Agoaspirato

L’agoaspirato è il prodotto di un’aspirazione tramite ago sottile (calibro 21-23 gauge) infisso in organi o tessuti superficiali o profondi. È rapido e indolore, con basso rischio di complicanze e consente di ottenere cellule sulle quali il patologo esprime un giudizio diagnostico. Può essere eseguito a mano libera (es. nodulo tiroideo o mammario) o sotto guida ecografica o TAC (agoaspirato polmonare o epatico o lesione superficiale ma non palpabile).

Vantaggi

• Scarso dolore (l’ago è molto sottile)
• Bassi costi
• Rapidità
• Screening: ad esempio, nel caso di nodulo tiroideo, è molto importante uno screening con agoaspirato (screening troppo invasivo quando la tecnica diagnostica era la chirurgia)

Limiti

• Non può esser utilizzata per lesioni dure o tessuti calcifici
• Non dà informazioni istologiche, ma solo citologiche
• La specificità (VN/ VN + FP) è maggiore della sensibilità (VP/ VP + FN): di conseguenza, la non ottimale sensibilità impone spesso la riesecuzione dell’esame (quando il campione è negativo).

Un buon test di laboratorio dovrebbe essere in grado di distinguere i soggetti affetti da una malattia rispetto ai sani. Questi parametri vengono indicati come “sensibilità diagnostica” VP/(VP + FN) e “specificità diagnostica” VN/(FP +VN).

• VP (veri positivi) è la percentuale di soggetti affetti, positivi al test;
• FP (falsi positivi) è la percentuale di soggetti sani positivi al test;
• FN (falsi negativi) è la percentuale di soggetti affetti negativi al test;
• VN (veri negativi) la percentuale di soggetti sani, negativi al test.

La tiroide, ad esempio, ha il problema che i FN sono molti, proprio perché è un organo riccamente vascolarizzato: quindi ha una bassa sensibilità! In questi casi, ossia nei casi di organi caratterizzati da una bassa sensibilità, è opportuno valutare molto attentamente, ripetendo l’esame, i negativi. La specificità, invece, è solitamente elevata in quanto i FP sono più rari.

Diagnosi in anatomia patologica: è come un puzzle costituito da molti pezzi

• Parametri clinici del paziente (con eventuali altri parametri strumentali o laboratoristici)
• Parametri macroscopici
• Parametri istologici: valutano l’architettura
• Parametri citologici: valutano la morfologia cellulare
• Parametri molecolari: IHC, marcatori, FISH

Condizione fondamentale per una corretta diagnosi è che il campione pervenga in laboratorio in condizioni ottimali di conservazione.

Flusso di lavoro in anatomia patologica – Preparati istologici

1. Accettazione dei campioni (infermiere)
2. Fissazione formalina (tecnico di laboratorio biomedico)
3. Prelievi (medico)
4. Inclusione paraffina (tecnico di laboratorio biomedico)
5. Taglio microtomo – criostato (tecnico di laboratorio biomedico)
6. Colorazione (tecnico di laboratorio biomedico)
7. Montaggio (tecnico di laboratorio biomedico)
8. Lettura al microscopio ottico (medico)

Accettazione del campione

La postazione di accettazione costituisce il punto di accesso dei campioni nel reparto di anatomia patologica. In questa fase l’operatore assegna al campione e alla corrispondente richiesta cartacea un codice identificativo univoco (ad esempio attraverso l’applicazione di un codice a barre adesivo sul contenitore del campione e sul documento cartaceo), in modo che esso possa essere correttamente distinto da tutti gli altri. Una volta che la richiesta è stata siglata e firmata dall’operatore, essa viene inviata alla segreteria dell’istituto in modo che i corrispondenti dati, corredati dalla storia clinica del paziente e/o dalle precedenti analisi cito-istologiche ed immunoistochimiche, vengano inseriti nel sistema informatico gestionale del laboratorio.

Campionamento

Una volta che le richieste sono state accettate dalla segreteria, si procede con il sezionamento e il campionamento dei pezzi operatori. L’attività di campionamento avviene sotto cappa e prevede l’intervento di due operatori, generalmente un medico e un operatore tecnico. Per ogni campione manipolato viene prodotto un referto che ne riporta la descrizione macro-bioptica e i codici delle istocassette ad esso associate (nelle quali sono stati inseriti dei pezzi del campione stesso).

Fissazione formalina – Analisi di un campione chirurgico

Scopo della fissazione:

• Interrompere velocemente e completamente i processi autolitici che si sviluppano nella cellula e nei tessuti non più nutriti ed ossigenati;
• Preservare i campioni dall'attacco di muffe e batteri che potrebbero proliferare nutrendosi delle strutture non più in grado di proteggersi;
• Conservare al meglio la morfologia strutturale ed ultrastrutturale del tessuto e della cellula.
• Consente al preparato di sopportare gli stress fisici e chimici insiti nelle successive fasi di disidratazione, inclusione e sezionamento.

Per prevenirne la decomposizione, i tessuti destinati all'analisi microscopica vengono trattati tramite un processo chiamato fissazione. La fissazione è resa necessaria dal fatto che, una volta asportati dall'organismo di appartenenza, i tessuti perdono rapidamente le loro proprietà chimiche e fisiche, sia a causa della variazione di temperatura e di pH, sia per l'azione dei microrganismi che, una volta asportato il tessuto, immediatamente attaccano e invadono il materiale biologico. Tramite la fissazione si riesce a ritardare, quando non a impedire, questi processi, e a questo scopo i tessuti appena prelevati vengono trattati con composti chimici quali alcoli e aldeidi, i quali, appunto, fissano le molecole presenti nel tessuto nello stato chimico e nella posizione in cui si trovano in vivo.

• Prelevato il campione bioptico, occorre lavorare alla sua conservazione: pertanto, si ricorre ad una pronta fissazione, per evitare eventuali alterazioni cellulari.

Tempi di fissazione

La durata della fissazione varia a seconda della natura del campione biologico in esame, della velocità di penetrazione del fissativo, ma soprattutto in base allo spessore del pezzo. La velocità di fissazione, inoltre, è direttamente proporzionale, non solo alla dimensione del tessuto, ma anche alla compostezza del tessuto stesso: pertanto, un campione di connettivo lasso si fissa più lentamente rispetto ad un campione di un tessuto più compatto.

• Riguardo il tessuto osseo, comunque, va precisato che esso è l’unico tessuto che necessita una decalcificazione prima della fissazione.

N.B. La fissazione errata può danneggiare irreversibilmente la morfologia impedendo una corretta diagnosi patologica ed impedendo l’applicazione di metodiche supplementari d’indagine (es. immunoistochimica).