Anatomia patologica

Anatomia patologica - Prof. Campani

Ruolo del tecnico di laboratorio biomedico

Nell'ambito della professione sanitaria del tecnico di laboratorio biomedico, i laureati sono operatori sanitari a cui competono le attribuzioni previste dal D.M. Ministero della Sanità 26 settembre 1994, n. 745 e successive modificazioni ed integrazioni. Sono responsabili degli atti di loro competenza, svolgono attività di laboratorio di analisi e di ricerca relative ad analisi biomediche e biotecnologiche ed in particolare di biochimica, microbiologia, parassitologia, virologia, farmaco-tossicologia, immunologia, patologia clinica, ematologia, citologia e istopatologia.

I laureati in tecniche diagnostiche di laboratorio biomedico svolgono con autonomia tecnico professionale le loro prestazioni lavorative in diretta collaborazione con il personale laureato di laboratorio preposto alle diverse responsabilità operative di appartenenza. Sono responsabili, nelle strutture di laboratorio, del corretto adempimento delle procedure analitiche e del loro operato, nell'ambito delle loro funzioni in applicazione dei protocolli di lavoro definiti dai dirigenti responsabili. Verificano la corrispondenza delle prestazioni erogate agli indicatori e standard predefiniti dal responsabile della struttura; controllano e verificano il corretto funzionamento delle apparecchiature utilizzate, provvedono alla manutenzione ordinaria e alla eventuale eliminazione di piccoli inconvenienti. Partecipano alla programmazione e organizzazione del lavoro nell'ambito della struttura in cui operano; svolgono la loro attività in strutture di laboratorio pubbliche e private, autorizzate secondo la normativa vigente, in rapporto di dipendenza o libero-professionale; contribuiscono alla formazione del personale di supporto e concorrono direttamente all'aggiornamento relativo al loro profilo professionale e alla ricerca.

Anatomia patologica

• Definizione - Disciplina morfologica applicata alla clinica;
• Finalità - Inquadramento nosologico (classificazione) delle malattie sul piano morfologico:
  • Macroscopico: riscontro diagnostico, pezzi operatori, biopsie ambulatoriali;
  • Microscopico: istologia, citologia, istochimica, immunoistochimica, ultrastruttura, biologia molecolare;
• Risultato dell'analisi - Si esprime con il referto cioè la descrizione (macro e microscopica) delle lesioni osservate con un giudizio conclusivo e sintetico;
• Attività:
  • Riscontro autoptico;
  • Diagnosi istologica;
  • Diagnosi citologica;
• Organizzazione:
  • Accettazione;
  • Trattamento del materiale istologico e/o citologico;
  • Refertazione;
• Organigramma - Costituito da un numero variabile di dirigenti medici (specialisti in anatomia patologica), biologi, tecnici di istopatologia, impiegati, ausiliari, borsisti, ricercatori, specializzandi in Anatomia Patologica, studenti.
• Settori: Diagnosi istopatologica - Eseguita su biopsia o pezzo operatorio con tre finalità:
  • Diagnostica – Accertamento di una malattia;
  • Prognostica – Benigna o maligna;

Neoplasie maligne

In caso di neoplasie maligne i parametri istopatologici da valutare sono:

• Tipizzazione istologica, istochimica e immunoistochimica (carcinomi, linfomi, sarcomi);
• Stadiazione patologica del tumore (pTNM) p sta per patologico, T (entità o infiltrazione locale), N (stato dei linfonodi), M (presenza di metastasi a distanza);
• Grado istologico G1-4 (ben diff.-scars. diff.);
• Indice mitotico (n. mitosi/10HPF);
• Follow-up post-operatorio – Progressione, recidive, metastasi;

Diagnosi citopatologica

• Citologia preventiva: Molto utilizzata nello screening di massa (genitale femminile, polmonare, urinaria);
• Citologia clinica: Accertamento citologico di lesioni sintomatiche (agoaspirato, versamenti cavità naturali);
• Riscontro diagnostico (numericamente in declino grazie alle moderne indagini come TAC);
• Accertamento morfo-funzionale di patologie che hanno portato a morte per cause naturali (non va confuso con l'autopsia medico-legale in cui la causa di morte non è naturale, ma violenta o indotta);

Epicrisi e limiti diagnostici

Gli eventi patologici riscontrati sul cadavere sono definiti Epicrisi: elenco di patologie ordinate in sequenza logica dalla causa iniziale, alla causa intermedia e a quella finale responsabile della morte. La causa terminale è riferita al deficit di uno dei tre organi vitali (cuore, cervello, polmone), ognuno dei quali, se colpito in maniera irreparabile, porta all'arresto funzionale degli altri due.

Ci sono però dei limiti diagnostici dell'esame necroscopico: la legislazione prevede un'osservazione di 24 ore prima del riscontro diagnostico. Si esegue, in caso di morte naturale, quando la causa di morte non sia stata ben inquadrata sul piano clinico per accertare le patologie concomitanti o conseguenti responsabili della morte del paziente. In Italia non è necessario il consenso dei pazienti ed è disposto dal medico curante.

Il primario (ospedale) o il medico curante (domicilio) compilano il certificato di morte che esclude cause non naturali e dispongono l'esecuzione del riscontro diagnostico presso il SAP più vicino. La documentazione clinica e l'anamnesi del paziente sono molto importanti per ricostruire la patologia che ha portato a morte il paziente. È sempre gradita la presenza del medico curante in sala settoria.

Modalità di richiesta degli esami

Per gli esami istologici e citologici è necessaria la compilazione di apposita scheda fornita dal Servizio di Anatomia Patologica che deve sempre accompagnare il campione. La scheda deve contenere:

• Generalità e dati anagrafici del paziente;
• Notizie cliniche recenti e precedenti anamnestici;
• Tipo, sede e data del prelievo;
• Descrizione della lesione – Tipo di lesione, dimensione, tempo di comparsa;
• Diagnosi clinica sospetta;
• Generalità e recapito del medico richiedente.

Materiale inviato

• Dalla sala operatoria – Organi prelevanti in corso di interventi chirurgici;
• Dagli ambulatori – Piccole biopsie;
• Dalla sala autoptica – Organi prelevati in corso di riscontro diagnostico.

Modalità di prelievo

Prelievi bioptici

• Biopsia escissionale: Asportazione in toto della lesione, deve contenere una parte centrale (la lesione) e una piccola zona periferica di tessuto sano da marcare con inchiostro se si sospetta una neoplasia (per lo studio dei margini di resezione);
• Biopsia incisionale: Asportazione parziale della lesione. Si esegue a scopo diagnostico e necessita di un secondo intervento (escissione radicale);
• Raschiamento: Raccolta di frammenti superficiali. Il prelievo è composto da numerosi e piccoli frustoli che impediscono la visione architetturale della lesione (genitale femminile, urinario);
• Punch biopsia: Molto usato in dermatologia, cavo orale. Prelievo minuto ottenuto mediante apposito strumento perforatore che consegna una carotina di tessuto;
• Ago biopsia: Omologabile al punch, ma il prelievo viene effettuato in organi interni (tiroide, fegato, prostata, linfonodo, ghiandole salivari, intestino, mammella, cuore, rene...) esplorati in ecografia o endoscopia durante il prelievo.

Prelievo citologico

• Per striscio del materiale: Ottenuto con tampone/spatola o raccolto da liquidi circolanti dopo centrifugazione;
• Per agoaspirazione con ago sottile: Vengono prelevati liquidi da cavità naturali o di organi superficiali;
• Per apposizione del vetrino sulla lesione durante le estemporanee;
• Per spazzolatura di superfici cave durante le endoscopie;
• Per lavaggio di una cavità – I raccolti vengono centrifugati a bassa velocità per non lisare le cellule.

Conservazione e inoltro del materiale

Conservazione

La conservazione del materiale è fondamentale per una corretta lettura di un preparato istologico e citologico. In alcuni casi il materiale fresco viene immediatamente congelato in azoto liquido a -170°C e mantenuto a -80°C per lo studio di DNA e RNA.

Il materiale subito dopo l'asportazione deve essere sottoposto ad opportuna fissazione, nella maggior parte dei casi si usa la formalina al 10% tamponata pH 7. La fissazione uccide le cellule e i tessuti e ne conserva le strutture morfologiche; i tessuti devono essere immediatamente, dopo il prelievo, immersi nel fissativo per evitare autodigestione e putrefazione.

Il materiale ottenuto nei riscontri diagnostici eseguiti 24h dopo il decesso è sempre in cattivo stato di conservazione, spesso irriconoscibile al microscopio. Organi facilmente deperibili sono: intestini, pancreas e stomaco. La durata media della fissazione è di 24h ma una fissazione più prolungata non danneggia il tessuto. Apparecchi speciali con vuoto e microonde riducono il tempo di fissazione in funzione dello spessore del campione.

I campioni fissati in formalina tamponata possono essere sottoposti a tutte le colorazioni (istologiche/istochimiche/immunoistochimiche) e anche se non perfettamente adeguati, allo studio ultrastrutturale (ME – richiesto di fissare il campione con gluteraldeide al 2,5% in tampone di Sorensen). La durata di questa fissazione è di 2h e il campione deve prima essere ridotto in frammenti millimetrici.

I preparati di citologia strisciati su vetrini in genere vengono fissati con cytospray che viene spruzzato a una distanza di circa 20cm dal vetrino. In questo modo il materiale si può conservare per molto tempo e inviare al laboratorio anche dopo giorni in contenitori di cartone o di plastica sigillati e protetti per evitare danni al vetrino. Sulla parte smerigliata del vetrino vengono scritte a matita le generalità del paziente. L'inchiostro della penna sarebbe cancellato durante l'allestimento e colorazione del vetrino.

Inoltro del materiale

Le biopsie e i pezzi operatori devono essere immerse in contenitori con almeno 2/3 di liquido fissativo. I contenitori in plastica devono essere etichettati e riportare le generalità, la data del prelievo, reparto di provenienza e devono essere accompagnati alla scheda informativa (polizza).

Il contenitore e la scheda vengono inviati al SAP dove sono registrati con un numero progressivo del sistema operativo del laboratorio che accompagnerà il pezzo, la scheda e i vetrini per tutto l'iter del ciclo lavorativo del laboratorio fino alla risposta definitiva e all'archiviazione. Anche per il materiale citologico i vetrini e la scheda vengono inviati al SAP dove sono registrati con un numero progressivo che accompagnerà il pezzo, la scheda e i vetrini per tutto l'iter del ciclo lavorativo del laboratorio fino alla risposta definitiva e all'archiviazione.

Fasi del ciclo lavorativo di un SAP

1. Accettazione, identificazione e registrazione del materiale con scheda informativa;
2. Lavorazione dei campioni – Campionamento del materiale/criosezione -> Controllo del patologo e tecnico;
3. Trattamento dei campioni – Processazione, inclusione e taglio -> Area tecnica di I livello;
4. Allestimento dei preparati – Colorazione e montaggio vetrini -> Area tecnica di II livello;
5. Lettura dei preparati al microscopio -> Area diagnostica del patologo;
6. Refertazione – Scrittura dei referti sul computer, firma dei referti -> Compito del patologo;
7. Archiviazione – Classificatori per materiale cartaceo, vetrini e blocchetti -> Area tecnica di III livello.

Metodiche di isto-citologia

Materiale fresco (non fissato) ricevuto dalle sale operatorie durante l'intervento chirurgico:

• Esame intraoperatorio: Sezioni al criostato colorate subito, risposta in 15’ dall’arrivo del materiale. Morfologia sub-ottimale e a volte non dirimente. Il campione dell’esame intraoperatorio viene scongelato a temperatura ambiente, fissato in formalina e avviato alla processazione per la diagnosi definitiva.

Materiale fissato proveniente dalle sale operatorie dopo l’intervento chirurgico:

• Esame macroscopico e campionamento - Estremamente importante eseguito da un patologo aiutato da un tecnico, consiste nella descrizione e misurazioni dei campioni, fotografie.
• Inclusione in paraffina - Con opportuni strumenti che prevedono la disidratazione in una scala crescente di alcol e la diafanizzazione in xilolo che consente la perfusione della paraffina liquida a 56°C. A temperatura ambiente viene eseguita l’inclusione in paraffina per cui si ottengono blocchetti in paraffina che contengono il materiale bioptico. La paraffina permette di tagliare il materiale per mezzo del microtomo e di porre le sezioni istologiche su un vetrino che saranno colorate e preparate per la lettura al microscopio.

Colorazione

La colorazione è indispensabile per la lettura di un preparato istologico nelle sue componenti cellulari: nucleo e citoplasma. La colorazione di base è l’ematossilina-eosina (nucleo viola, citoplasma rosa)

1. Xilolo 5’x2
2. Etanolo a varia gradazione (99°, 95°) 5’x2
3. Acqua distillata
4. Ematossilina di Mayer 5’
5. Acqua di fonte 5’
6. Acqua distillata
7. Eosina 5’
8. Alcol 95°, 99°, xilolo
9. Montaggio con balsamo del Canada

Colorazioni speciali - Istochimiche e immunoistochimiche, preferibile non usare campioni congelati e scongelati (estemporanee). I preparati citologici si colorano con Papanicolaou, Giemsa, Ematossilina-Eosina e colorazioni speciali come per i campioni istologici (immunoistochimica, FISH).

Decalcificazione e inclusione in resina per ME

Decalcificazione - I tessuti duri (osso, denti) una volta fissati sono immersi in soluzione acida decalcificante, quindi inclusi in paraffina e sezionati come i tessuti molli.

Inclusione in resina per ME - I tessuti molli e duri sono fissati in gluteraldeide prima di essere inclusi in resina sintetica, più dura della paraffina, che permette il taglio di sezioni semi fini all'ultramicrotomo in modo da consentire una lettura al microscopio elettronico.

Iter di procedura nel laboratorio di anatomia patologica

1. Fase propedeutica;
2. Fase propedeutica di laboratorio;
3. Fase preanalitica;
4. Fase analitica;
5. Fase post-analitica;
6. Fase interpretativa;
7. Refertazione.

Fase propedeutica

• Istologia - Richiesta dell’esame dal reparto/dalla divisione ospedaliera interna/da medico esterno con allegate le notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta dell’esame insieme all’invio del reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza) + Richiesta di riscontro diagnostico.
• Citologia - Richiesta dell’esame dal reparto/dalla divisione ospedaliera interna/da medico esterno con allegate le notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta dell’esame insieme all’invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo.

Fase propedeutica di laboratorio - Istologia

• Ricezione biopsie;
• Classificazione e numerazione reperti su un apposito sistema operativo interno annuale progressivo;
• Riduzione dei reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia;
• Procedura di fissazione e processazione dei tessuti in processatore automatico (auto tecnico) (circa 15h);
• Accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei.

Fase pre-analitica – Istologia

• Inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati;
• Preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni;
• Raccolta sezioni istologiche di circa 3µ su vetrini, loro fissazione in stufa a secco termostatata, procedimento paraffinatura in solventi;
• Per esame al criostato: Riduzione campione e taglio sezioni.

Fase analitica – Istologia

• Vengono effettuate colorazioni di routine EE o colorazioni speciali;
• Vengono effettuate reazioni specifiche di immunoistochimica;
• Si ha il montaggio dei vetrini in mezzo di inclusione idoneo;
• In alcuni casi si fa la colorazione per esame al criostato;
• Si ha il controllo di qualità usando sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo e/o controlli inter-laboratorio.

Fase post-analitica – Istologia

• Apposizione di etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate;
• Archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina;
• Consegna dei vassoi contenenti i vetrini e delle relative polizze al medico anatomo-patologo specialista.

Fase interpretativa – Istologia

• Osservazione dei vetrini al microscopio ottico;
• Interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo;
• Controllo di qualità: Lettura dei vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore + lettura alla cieca inter-laboratorio.

Refertazione

• Inserimento sul computer del referto in archivio informatico dedicato;
• Consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente;
• Archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche;
• Archiviazione documentazione cartacea;
• Archiviazione documentazione informatica.

Fissazione dei tessuti

La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’uso di fissativi idonei a preservare nello stato migliore possibile la struttura del campione. La fissazione fornisce un’immagine statistica di un tessuto.

Definizione: Trattamento chimico che porta all’immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi. La forma delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione originaria.