Anatomia Comparata, prof. Colombo

Modelli per studiare lo sviluppo embrionale

Ci sono modelli per studiare lo sviluppo embrionale e tra i più usati ci sono Xenopus laevis, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, Mus musculus, Gallus gallus ed infine i ricci di mare.

Fenomeni fondamentali dello sviluppo

Lo sviluppo deve garantire tre fenomeni fondamentali:

• Accrescimento mediante mitosi e crescita cellulare
• Differenziamento grazie alla diversa espressione genica
• Morfogenesi: formazione di determinate strutture che dipendono dai geni attivi presenti nella data popolazione cellulare

Tappe dello sviluppo di un individuo

Le tappe dello sviluppo di un individuo sono:

• Gametogenesi
• Fecondazione (origina lo zigote)
• Segmentazione (proliferazione cellulare)
• Gastrulazione (formazione dei foglietti embrionali)
• Organogenesi

Gametogenesi

Alla base della gametogenesi c'è la meiosi preceduta da una serie di mitosi a carico delle cellule germinali primordiali. Gli spermatogoni sono presenti nei maschi mentre gli oogoni nelle femmine. La gametogenesi avviene nelle gonadi a partire da cellule germinali primordiali (PGC) che colonizzano la gonade in fase di sviluppo. Nei maschi, in particolare, la gametogenesi è regolata da ormoni dell'asse ipofisi-ipotalamo. Lo spermatozoo è caratterizzato da motilità mentre l'ovocita sviluppa un complesso e ricco citoplasma con numerosi determinanti morfogenetici. Nella sperimentazione su anfibi, la gametogenesi viene indotta con l’ormone umano HCG (Human Chorionic Gonadotropin).

Spermatogenesi

Per ogni spermatogonio si formano 4 spermatidi.

• Spermatogonio: Cellule 2n che attuano mitosi, hanno N coppie di cromosomi omologhi (23 nell’uomo)
• Spermatocita I: DNA duplicato prima della meiosi I
• Spermatocita II
• Spermatidio: Cellula n con i cromatidi fratelli separati

La spermioistogenesi trasforma poi gli spermatidi in spermatozoi. Gli istoni sono rimpiazzati da protammine che condensano maggiormente il DNA. Gli spermatidi vanno incontro a maturazione morfologica e a una distribuzione di recettori di membrana per il riconoscimento della cellula uovo.

Ogni spermatozoo presenta:

• Testa
• Nucleo
• Vescicola acrosomiale (Acrosoma): Ricca di enzimi litici di derivazione golgiana e lisosomiale. Questa polarizzazione inizia già a livello dello spermatidio con il Golgi e un centriolo diametralmente opposti. Il citoscheletro modella la posizione della vescicola.
• Manicotto: Ricco di mitocondri
• Flagello: Ricco di tubulina

Oogenesi

Per ogni oogone si forma un uovo maturo e 3 corpuscoli polari.

• Oogonio: Cellula 2n che attua mitosi, hanno N coppie di cromosomi omologhi (23 nell’uomo)
• Oocita I: DNA duplicato prima della meiosi I. Forma un oocita II e un corpuscolo polare
• Oocita II: Cellula n con tutto il citoplasma. Con la meiosi II origina un uovo maturo e un corpuscolo polare
• Corpuscolo polare: Cellula n senza citoplasma, con la meiosi II origina 2 corpuscoli polari

La cellula uovo è caratterizzata da un polo animale e un polo vegetativo: il polo animale serve a originare strutture che mettono l’organismo in contatto con l’ambiente esterno. Il polo vegetativo è la zona in cui il vitello è accumulato e origina l’apparato digerente e le altre strutture vegetative. Il nucleo è spostato verso il polo animale così come i fattori morfogenetici e l’mRNA. Il fuso mitotico dell’oocita I è molto polarizzato per formare due cellule diverse. Nella donna, la fecondazione avviene nell’oocita II, il suo prodotto sono quindi lo zigote e un globulo polare. L’oocita umano misura circa 0,1 mm, quello di anfibio 1 mm. La fecondazione avviene a livello di oocita I in: Nematodi, Spugne, Molluschi, Canidi. A livello della metafase I in: Insetti, Molluschi, Echinodermi. A livello di metafase II (oocita II): Mammiferi, Pesci, Anfibi, Anfiosso. A livello di ovocita maturo: Cnidari, Echinoidei.

Deposito citoplasmatico

Il citoplasma dell’oocita contiene proteine energetiche ed amminoacidi. È molto presente la vitellogenina che forma il vitello (deutoplasma) prodotta dal fegato della madre e arriva all’ovocita tramite il circolo. Contiene anche placche lipidiche. Nel citoplasma ci sono anche subunità ribosomiali stoccate, tRNA per la sintesi proteica e mRNA mascherato fino a fecondazione avvenuta. È una sorta di troposfera metabolica. I determinanti morfogenetici sono localizzati in punti specifici del citoplasma e con la segmentazione vengono distribuiti in varie cellule abbassando la totipotenza dello zigote alla pluripotenza dei blastomeri. Nell’ooplasma ci sono anche fattori protettivi come ad esempio contro le radiazioni UV (per organismi a sviluppo esterno). L’accrescimento volumetrico del citoplasma è un processo noto con il nome di auxocitosi.

Classificazione delle cellule uovo

Le cellule uovo vengono classificate in base alla quantità di vitello:

• Oligolecitiche (Riccio di mare 0,1 mm)
• Mesolecitiche (Anfibio 1 mm)
• Macrolecitiche
• Centrolecitiche (1 mm)
• Telolecitiche (1 cm)
• Alecitiche (uomo 0,1 mm)

Involucri accessoriali

Gli involucri accessoriali all'esterno dell’oolemma regolano il processo di fecondazione e proteggono l’embrione nelle prime fasi di sviluppo. Negli Aves e Reptilia, alcuni esempi sono l’albume e il guscio. Nei mammiferi c’è una sola membrana per regolare la fecondazione.

Membrane in natura

In natura esistono due tipi di membrane:

• Membrana I: Si ipotizza che si sia formata sia dall’oocita che dalle cellule follicolari. Si forma nell’ovaio e la sua funzione principale è il riconoscimento dello spermatozoo. Le membrane I sono anche note come membrane acellulari. Sono rivestimenti fibrosi costituiti da glicoproteine essenziali per il processo di fecondazione dato che c’è un legame specie-specifico tra i due gameti. Induce la reazione acrosomiale regolando l’entrata dello spermatozoo e successivamente neutralizzando gli altri tramite la rimozione dei siti di riconoscimento, in questo modo si evita la polispermia. La membrana I blocca al suo interno il primo corpuscolo polare che dopo la fecondazione andrà perso. A contatto con l’oolemma, ne sono esempi la zona pellucida (uomo), l’involucro vitellino (anfibi) o la membrana vitellina (invertebrati).
• Membrana II: Nei vertebrati terrestri ovipari questo involucro si forma nell’ovidotto quando le uova sono in transito. Negli anfibi è composta da un involucro gelatinoso. In rettili e uccelli c’è l’albume, due membrane testacee e il guscio. L’albume è stratificato e contiene acqua e amminoacidi. Il guscio è di CaCO₃ e poroso. Questa membrana attiva lo spermatozoo.

Non tutte le specie hanno entrambe le membrane, ma tutte presentano quella primaria.

Oolemma

L'oolemma può fondersi con la membrana dello spermatozoo e regola un flusso di ioni al momento della fecondazione. Al di sotto dell’oolemma (nella regione del cortex) è presente actina globulare e granuli corticali. Quest’ultimi si perdono dopo la fecondazione e contengono enzimi e mucopolisaccaridi, glicoproteine ialine e di adesione. I granuli sono di chiara derivazione golgiana e gli enzimi, al momento della fecondazione, sono esocitati dai granuli staccando porzioni di membrana vitellina. Le glicoproteine favoriscono l’adesione tra i primi blastomeri.

Fecondazione

La fecondazione è il processo che porta alla formazione dello zigote, la prima cellula di un nuovo individuo.

Interazione spermatozoo-oocita

• Chemiotassi: Lo spermatozoo viene attratto dall’oocita mediante molecole specifiche. Le uova di riccio di mare rilasciano il fattore chemiotattico solo dopo la meiosi II. Nell’uomo avviene anche la "Termotassi" per orientare gli spermatozoi nell’ampolla che ha ovulato. Negli individui a fecondazione esterna questo processo è a lungo raggio, mentre per gli organismi a fecondazione interna (mammiferi) ha un raggio più ridotto.
• Contatto dei gameti: Negli anfibi c’è uno spesso strato gelatinoso che attiva gli spermatozoi e protegge l’oocita, la seconda barriera è invece costituita dalla membrana vitellina. Il contatto tra i due gameti può essere suddiviso in:
  1. Contatto dello spermatozoo con lo strato gelatinoso. In qualsiasi taxon lo spermatozoo attacca l’oocita nel polo animale.
  2. Reazione acrosomiale: La vescicola acrosomiale determina la reazione acrosomiale ed essa è una vescicola enzimatica polarizzata. La membrana acrosomiale esterna e la membrana plasmatica dello spermatozoo adiacente vengono perse durante la reazione acrosomiale per favorire la fuoriuscita di enzimi proteolitici per digerire lo strato gelatinoso. Sulla membrana acrosomiale interna invece ci sono dei recettori per la membrana vitellina. Nei mammiferi avviene anche la "capacitazione" prima della reazione acrosomiale ed avviene durante il transito degli spermatozoi nelle vie genitali femminili.
  3. Processo acrosomico: L’actina polimerizzata estrude la membrana acrosomiale interna esponendo la bindina per il legame. Gli spermatozoi dei ricci di mare sono legati alla membrana vitellina tramite un legame bindina-recettori di membrana. La bindina è una glicoproteina del peso di 30 kDa i cui recettori si trovano sulla membrana vitellina. Negli anfibi ci sono recettori "Bindina-simili" che interagiscono con i recettori dell’involucro vitellino, sulla membrana dello spermatozoo ci sono dei recettori che interagiscono con molecole dello strato gelatinoso. Nell’uomo i recettori sono nella zona pellucida. La bindina è contenuta nella parte interna nella vescicola acrosomiale.
  4. Fusione della membrana spermatica con quella plasmatica dell’oocita avviene attraverso l’apertura di canali Ca²⁺.
  5. Cono di fecondazione: Sollevamenti citoplasmatici formati da actina filamentosa dell’oocita che inglobano il nucleo dello spermatozoo. I suoi mitocondri vengono eliminati mentre i centrioli vengono conservati dall’oocita.

Inibizione dalle polispermie

• Blocco rapido: Entro 3” dalla fusione delle membrane il potenziale di membrana dell’oocita passa da -70 mV (naturale) a +20 mV per ingresso di ioni Na provenienti dall’ambiente acquatico circostante. Il potenziale positivo dura un minuto e blocca gli altri spermatozoi. Questo processo è stato osservato nei ricci di mare e negli anfibi.
• Blocco lento: A carico dei granuli corticali che degradano i recettori della bindina così da non poter più legare altri spermatozoi. Si attiva un minuto dopo la fusione delle membrane. I granuli si fondono con l’oolemma modificando la membrana vitellina, l’esocitosi è di enzimi litici (serin-proteinasi) dei ponti proteici tra oolemma e membrana vitellina, quest’ultima quindi si scolla dall’oolemma portando con sé gli altri spermatozoi. Il distacco è inoltre favorito dai mucopolisaccaridi che richiamano acqua. La membrana vitellina dopo la fecondazione viene chiamata membrana di fecondazione, nell’uomo invece si chiama zona pellucida reagita. Una perossidasi forma legami crociati a livello della membrana di fecondazione per renderla più consistente mentre le proteine ialine formeranno un sostegno alla segmentazione.

Riorganizzazione citoplasmatica

È un processo necessario per il differenziamento cellulare nelle successive fasi dello sviluppo. L’entrata dello spermatozoo determina la rotazione del polo animale verso quello vegetale con la formazione di una semiluna grigia. Questa rotazione è possibile grazie all’azione dei microtubuli che fanno ruotare di 30° in cortex del polo animale. La semiluna si forma sempre diametralmente opposta alla zona di ingresso dello spermatozoo ed in essa si concentrano i determinanti morfogenetici dorsali. A livello dello zigote è quindi già possibile identificare l’asse dorso-ventrale per la presenza di questa semiluna. Dalla parte opposta si concentreranno quindi i determinanti morfogenetici ventrali. Un esempio di riorganizzazione citoplasmatica e ridistribuzione dei determinanti morfogenetici osservato in Xenopus laevis è il seguente: la β-catenina (componente citoscheletrica) è distribuita uniformemente nel polo animale così come la Glicogeno-sintetasi Kinasi 3 (GSK-3) che è però contenuta in vescicole e ha come effetto quello di degradare la β-catenina. Nel polo vegetale c’è invece un enzima GSK-3 inibitore. Successivamente alla fecondazione l’inibitore viene rilasciato e inizia ad inibire la GSK-3 presente nelle sue vicinanze favorendo la presenza di β-catenina. Risulta che la β-catenina si accumula nella regione dorsale mentre nella parte opposta (ventrale) dove l’inibitore non arriva sarà concentrata dalla GSK-3. A fine segmentazione si avrà quindi una blastula con cellule dorsali ricche di β-catenina, un fattore importante per la specializzazione di quella regione dell’embrione.

Segmentazione

L’obiettivo della segmentazione è trasformare lo zigote in blastula, approdare quindi alla pluricellularità. Ogni cellula è detta blastomero. Le mitosi che si susseguono non sono tradizionali infatti le fasi di G1 e G2 vengono abolite, di conseguenza le cellule non si accrescono volumetricamente. In questo modo si aumenta la velocità di duplicazione. In Xenopus laevis ogni divisione avviene in 30’ e in circa 6h termina la segmentazione, nell’uomo la segmentazione dura circa un giorno. Gli anfibi con uova mesolecitiche hanno una segmentazione radiale diseguale oloblastica. Il primo piano di segmentazione taglia a metà la semiluna grigia, restano quindi tracce di polo animale e vegetale nei primi due blastomeri. Il secondo solco è perpendicolare al primo e forma una croce nella zona del polo animale. Il terzo solco è equatoriale nella zona del polo animale. Gli altri piani non seguono uno schema preciso e sono processi più rapidi. Al polo animale le cellule sono più piccole e sono chiamate micromeri mentre nel polo vegetale mantengono dimensioni maggiori e sono dette macromeri, questa differenza è dovuta alla segmentazione diseguale sopracitata.

Morula: Embrione con 16-64 cellule

Blastula: Embrione con più di 128 cellule ed il blastocele

La segmentazione procede finché il rapporto nucleo/citoplasma in ogni cellula non è riportato a ½. I macromeri sono uniti da caderine (giunzioni aderenti). Nella blastula matura i blastomeri sono indistinguibili dal punto di vista citologico ma contengono determinanti morfogenetici diversi.

Gastrulazione

L’obiettivo della gastrulazione è la formazione dei tre foglietti embrionali a partire da una "Mappa dei territori presuntivi": Endoblasto, Mesoblasto, Ectoblasto. La gastrulazione inizia sempre a livello della semiluna grigia. La gastrulazione è poco caratterizzata da mitosi mentre sono molto presenti movimenti cellulari che modificano le posizioni reciproche dei blastomeri. La volta del blastocele forma l’ectoblasto (caratterizzato da una limitata proliferazione cellulare), il pavimento l’endoblasto ed equatorialmente c’è il mesoblasto. I due movimenti cellulari principali sono:

• Involuzione: Mesoblasto ed Endoblasto migrano verso l’interno dell’embrione
• Epibolia: Espansione dell’Ectoblasto che va a rivestire l’embrione scivolando sui foglietti sottostanti

Le cellule durante la gastrulazione assumono due comportamenti:

• Epiteliale
• Mesenchimale: Le cellule si svincolano dalla lamina basale

Le cellule a margine di mesoblasto ed endoblasto si allungano con polimerizzazione di microtubuli in un determinato punto della blastula costituendo una popolazione di cellule a bottiglia che formano il labbro superiore del blastoporo in concomitanza con l’inizio dell’epibolia. Le cellule che mano mano si avvicinano al labbro perdono di adesività e diventano di tipo mesenchimale, il margine guida per il loro movimento è la volta del blastocele. Il blastoporo si forma a livello della semiluna grigia. Nei protostomi le cellule a bottiglia diventeranno la futura regione faringea del tubo digerente. Queste cellule formano il margine guida dell’archenteron. Quando il blastoporo continua ad allungarsi si trascina dietro di sé le popolazioni cellulari endoblastiche adiacenti. Nel frattempo per epibolia l’ectoblasto ricopre il tutto. Le prime cellule del mesoblasto che sono state trascinate dalle cellule a bottiglia diventeranno la "Placca Precordiale". Il secondo gruppo diventerà invece la notocorda, nell’uomo essa permane nei nuclei polposi dei dischi intervertebrali protetti da una guaina cartilaginea. Il blastoporo successivamente si allarga formando le due zone laterali e chiudendosi in una vera e propria fessura con il labbro ventrale; ogni zona istruisce le cellule di passaggio sul loro destino. Una volta finita la gastrulazione si forma il tappo vitellino di sole cellule endoblastiche che restringendosi formerà l’ano (protostomi). Sul finire della gastrulazione inizia già la neurulazione. A fine gastrulazione si identificano il Proctodeo e lo Stomodeo.

Organogenesi

Neurulazione

La notocorda (mesoderma) istruisce l’ectoderma sovrastante a diventare ectoderma neurale, il resto dell’ectoderma diventerà invece epidermide. Questo processo inizia quindi per induzione (primaria) in quanto una specifica regione dell’embrione interagendo con un’altra regione ne influenza il differenziamento lungo una via differenziativa. Il tubo neurale formerà l’encefalo anteriore, il cervelletto e il midollo spinale posteriore. La "Neurula" è l’embrione ad inizio neurulazione.

Neurulazione I

Inizia con la "Piastra neurale" formata dalle cellule competenti ectodermiche. Diventano cellule colonnari a seguito dei segnali della notocorda.