Analisi strumentale

ANALISI STRUMENTALE

ANALISI PONDERALE: insieme di operazioni che debbono essere impiegate per determinare un

principio attivo tramite una pesata che rappresenta lo stadio finale della determinazione stessa.

ANALISI VOLUMETRICA: analisi che è completata misurando un volume di una soluzione a

concentrazione nota, necessario per avere una reazione quantitativa con la sostanza che deve essere

determinata. • Titolazioni acido-base in fase aq. • Titolazioni indiretta in fase aq. • Titolazioni in

solventi non aq. • Titolazioni con formazione di precipitato • Titolazioni complessometriche e

chelometriche • Titolazioni redox • Titolazioni potenziometriche

ANALISI STRUMENTALE: Metodi spettroscopici : spettroscopia UV-VIS, fluorescenza .

Metodi cromatografici: HPLC, GC . Si cerca di essere selettivi per separare l’analita di interesse

anche in presenza di interferenti .

Analisi quantitativa: determinazione della quantità di una o più sostanze note (analiti) di un campione

Matrice: ambiente in cui è disperso l’analita . La matrice è tutto ciò che non è analita ( la sostanza di

interesse che può essere il principio attivo o l’impurezza )

L’analisi quantitativa può essere relativa a matrici semplici o complesse . Può essere applicata a

diversi livelli . Per gli antibiotici è richiesta analisi con HPLC , la titolazione volumetrica non può

essere usata perchè hanno diverse forme e qualità .

La forma farmaceutica è costituita da API ed eccipienti .

La titolazione non può essere applicata per matrici biologiche complesse come plasma , urine , feci

che sono un insieme di un numero elevato di componenti . Sono richieste tecniche separative , non

compare più l’UV ( spettroscopia ) , questa permette di avere la giusta selettività .

La formulazione farmaceutica con matrice più semplice da analizzare è la fiala perchè è iniettabile

quindi il componente principale è acqua sterile eventualmente tamponata con sali per la corretta

osmosi , il composto è direttamente in vena , intramuscolo o inalato . Non tutte le preparazioni

farmaceutiche hanno la stessa complessità . Le urine sono più semplici del plasma per l’assenza delle

proteine .

Metodi analitici assoluti o relativi

Metodi analitici assoluti

Permettono di ricavare direttamente il dato senza dover eseguire operazioni di calibrazione. La

correlazione fra la grandezza misurata e la quantità di analita è univocamente determinata da leggi

fisiche (es. tecniche gravimetriche (precipitazione) e coulometriche , indice di rifrazione ). A tale

categoria appartengono anche le titolazioni, nelle quali la quantità di analita viene determinata

sfruttando una reazione chimica con un reagente a concentrazione nota aggiunto fino all’equivalenza

stechiometrica con l’analita presente nel campione (standardizzazione).

Metodi analitici relativi

Richiedono la costruzione di una curva di calibrazione, che descrive la relazione fra il segnale

misurato e la concentrazione dell’analita ottenuta per interpolazione . Tutte le tecniche strumentali

ricadono in questa categoria perchè la risposta di uno strumento influenza il dato che si legge e di

conseguenza si deve tarare la risposta ed ottenere una correlazione tra il segnale letto e la

concentrazione dello standard , si tratta infatti di metodi comparativi . La curva di calibrazione si

ricava attraverso la misura di soluzioni standard (campioni a concentrazione nota di analita).

Tre fondamentali metodi per l’analisi quantitativa relativa: -Metodo della curva di taratura con

standard esterno -Metodo dello standard interno -Metodo delle aggiunte standard

INTERFERENTI sostanze presenti nel campione, che modificano il segnale che l’analita darebbe in

loro assenza - Somiglianza con l’analita e scarsa selettività del metodo - Interazione con l’analita

-Produzione di un rumore di fondo

MATRICE: insieme di tutte le sostanze che accompagnano l’analita nel campione in esame

EFFETTO MATRICE: alterazione del segnale (linea di base ) prodotta dalla presenza della matrice (di

altri componenti )

RUMORE DI FONDO dovuto a fluttuazioni nella risposta del rivelatore e del circuito elettrico ( è

dovuto allo strumento)

SOLUZIONI DI CONTROLLO soluzioni a contenuto noto di analita che servono a l’accuratezza del

metodo, e la sua precisione . Soluzione stock che l’operatore genera per pesata e quindi a

concentrazione nota , per diluizione della stock abbiamo quelle di lavoro usate per raggiungere la

concentrazione desiderata e costruire la retta di calibrazione .

Bisogna capire la scelta del metodo per la determinazione della retta di calibrazione

METODO DELLA CURVA DI TARATURA CON LO STANDARD ESTERNO

Abbiamo a disposizione l’analita in forma pura .

Quando è possibile ricostruire la matrice, o è nota o dopo che abbiamo dimostrato che gli elementi

presenti nella matrice non danno interferenza (questi potranno essere rimossi) con l’analisi successiva

, oppure si introducono tutti gli elementi che danno interferenze nelle nostre soluzioni di lavoro e

stock .

Le condizioni di analisi devono essere le stesse in cui si troverà l’analita al momento dell’analisi (ad

esempio il solvente usato nella SPE)e non l’analita nella sua forma originaria che potrebbe subire un

processo di preparazione del campione .

1) Si preparano vari campioni contenenti quantità note (xi) di analita nella stessa matrice del

campione incognito o in una matrice equivalente (soluzioni standard). 2) Si sottopone ciascuno

standard alla misura strumentale. 3) Si riporta in grafico la grandezza misurata (segnale strumentale)

per le soluzioni di standard a concentrazione nota in funzione della concentrazione 4) Si applica un

metodo statistico (regressione lineare - metodo dei minimi quadrati) per determinare la curva che

meglio si adatta ai punti sperimentali 5) Si sottopone il campione incognito alla misura strumentale. 6)

Si esegue una interpolazione sulla curva di taratura per calcolare il valore di concentrazione incognita.

Scelta dell’intervallo di concentrazione in cui costruire la retta di calibrazione avviene in funzione

della concentrazione dell’analita che ci si aspetta di avere dopo analisi . La concentrazione incognita

dell’analita deve posizionarsi preferibilmente al centro della retta di calibrazione . Quindi la retta di

calibrazione deve essere costruita a concentrazioni che vanno dalla ipotesi concentrazione dell’analita

in alto e in basso ovvero tra l’80 e il 120 % del contenuto stimato di analita .

Dobbiamo essere sicuri che nel caso in cui la formulazione abbia una quantità di analita superiore (

sovradosaggio ) o inferiore ( perchè si è degradato ) rispetto alla stima il valore ricada comunque nella

retta di calibrazione .

Questo non si verificherebbe lavorando agli estremi della retta di calibrazione .

METODO DELLA CURVA DI TARATURA CON LO STANDARD INTERNO

Deve essere presente l’analita standard puro . Occorre poi utilizzare anche uno standard interno

.Caratteristiche dello standard interno: Lo standard interno- deve avere caratteristiche chimico-fisiche

simili all’analita senza dare interferenze- Non essere presente nella matrice da analizzare per cui non

si può usare come standard interno uno degli eccipienti - Essere ben risolto dagli altri componenti

-Avere un Tempo di ritenzione simile a quello dell’analita ma distinto così come il max di

assorbimento -Avere una concentrazione simile a quella dell’analita - Non contenere impurezze - Non

reagire con il campione

Una quantità nota di standard è addizionata ad ognuno dei campioni da analizzare in concentrazione

costante . Il metodo dello standard interno viene utilizzato prevalentemente in cromatografia , ovvero

quando il metodo prevede passaggi che danno origine ad errori non quantificabili dall’operatore ,

l’errore è irripetibile . Se lo si può quantificare si applica standard esterno . Curva di calibrazione su

soluzioni a contenuto noto di analita a cui viene aggiunta la stessa quantità di standard interno.

Prepariamo solu a conc crescenti dell’analita standard ad ogni solu compreso il bianco si aggiunge lo

stesso volume di una concentrazione costante dello standard interno . Il segnale relativo all’analita è

crescente mentre quello relativo a quello interno è costante . Si calcola poi il rapporto segnale analita

nel campione/segnale std interno ( si può far riferimento anche alle aree in colonna cromatografica o

all’intensità del segnale nel caso dello spettrometro di massa )

Si costruisce il grafico riportando in ascissa la concentrazione di analita e in ordinata il rapporto tra il

segnale misurato per l’analita rispetto a quello dello standard interno (Sx /Sstandard interno) . Si

ottiene una retta che passa per 0. Per interpolazione si calcola la concentrazione dell’analita incognito

. Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno al campione e si effettua la stessa misura.

Tramite l’equazione della curva di calibrazione, si determina la concentrazione della specie in esame

nel campione stesso. [Misura dei segnali di analita e standard interno del bianco (Sb , *Sb ), degli

standard (S1 , *S1 , …) e del campione (S, *S) . Sottrazione dei segnali del bianco ai segnali di analita

e standard interno di standard e campione per ottenere i segnali corretti (S1 ’, *S1 ’, … S’, *S)

Calcolo della concentrazione del campione mediante interpolazione del rapporto fra i segnali corretti

di analita e standard interno del campione sulla retta di calibrazione (effettuata graficamente oppure

utilizzando l’equazione della retta di calibrazione) Costruzione della curva di calibrazione usando i

rapporti fra i segnali corretti di analita e standard interno degli standard e le concentrazioni di analita ]

.

Lo standard interno serve a normalizzare il segnale dell’analita . Importante tutte le volte in cui

possiamo avere una variabilità del metodo che non riusciamo a quantificare (oscillazione della

concentrazione ) . Esempio è l’iniezione in DC che è soggetta ad un errore casuale perchè l’iniettore è

una camera priva di buco immediatamente connessa con la colonna , iniettando piccole quantità di

soluzione 10 microlitri per cui l’errore di 0,1 corrisponde al 10 % , se la solu evapora aumentano le

concentrazioni sia dell’analita che dello standard interno e quindi il rapporto rimane invariato , se si

perde o se ne mette troppo in ogni caso il rapporto rimane invariato .Lo standard interno non può

compensare l’errore dell’operatore ma solo quelli casuali del metodo .

Nella SPE si usa lo standard esterno , non sempre si estrae il 100 % e quindi si ha una perdita

quantificabile perchè possiamo quantificare la resa di estrazione . Dopo interpolazione il dato ottenuto

va corretto con il recupero il quantitativo ottenuto : 95 = x :100 Tutte le volte che si può quantificare

la perdita si usa quello esterno

Applicabilità del metodo dello standard interno I. Disporre di uno standard interno molto simile

all’analita. II. Lavorare all’interno dell’intervallo lineare. III. Verificare che il recupero analitico

relativo di analita e standard interno sia vicino al 100%. Vantaggi del metodo dello standard interno 1)

è applicabile anche laddove una retta di taratura darebbe scarsa precisione. 2) Rende possibile una

determinazione quantitativa anche quando non si disponga di uno standard puro di analita ma si

conoscano i fattori di risposta.

METODO DELLE AGGIUNTE STANDARD

Serve sempre lo standard commerciale o puro

il metodo più usato per compensare le interferenze dovute a matrici più o meno complesse che danno

interferenze e non possono essere riprodotte perchè non commerciali . Usato prevalentemente per le

matrici biologiche ad alta probabilità di dare interferenza e non riproducibili perchè soggetto

dipendente .

Svantaggio : è necessario un volume elevato di campione per generare tutti i punti della retta di

calibrazione

Procedimento:

Si considera il bianco che può essere la stessa matrice semplificata

1) Si preparano n aliquote uguali dello stesso campione incognito. 2) Alle aliquote dalla 2 alla n si

aggiungono quantità note di standard crescenti ( nella 1 non si aggiunge nulla ) 3) Si portano tutte le

aliquote allo stesso volume Si ottengono così n standard caratterizzati da una certa quantità aggiunta

4) Si sottopone ciascuno standard alla misura strumentale. 5) Si riportano in grafico i punti

sperimentali in funzione della conc finale di standard 6) Una volta ottenuta la retta, si valuta

l’intersezione di tale retta con l’asse delle ascisse (-Cx). Il valore ottenuto, cambiato di segno

corrisponde alla concentrazione dell’analita nel campione.

0 ha solo il campione da analizzare che ha una % dell’analita ( plasma del soggetto che ha assunto il

farmaco )

da 1 a 4 abbiamo aggiunto concentrazioni crescenti del nostro farmaco di interesse

Il punto 0 ( senza standard ) contiene già un certo quantitativo del farmaco e corrisponde alla nostra

incognita . Gli altri punti contengono sempre la stessa concentrazione incognita costante in tutti i

punti e una parte addizionata . La retta avrà sulle y il segnale mentre sulle x la concentrazione dello

standard aggiunto . La retta interseca nel secondo quadrante l’asse delle x in un punto che è pari alla

concentrazione dell’analita . Il risultato è ottenuto per estrapolazione alla y=0

Metodo delle aggiunte standard: Vantaggi - Permette di effettuare l’analisi quantitativa per analiti in

matrici incognite o complesse - Si può applicare in tutte le tecniche analitiche strumentali sia

spettrofotometriche che elettrochimiche o cromatografiche. Metodo delle aggiunte standard:

Svantaggi -L’analisi richiede un tempo maggiore, poiché per ogni campione in esame deve essere

costruita e misurata una curva di calibrazione - È necessario un volume maggiore di campione rispetto

alla quantità che si utilizza con la retta di calibrazione. -È un metodo per estrapolazione, teoricamente

meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di calibrazione. -E’ fondamentale avere a

disposizione un bianco adeguato, che permetta di eliminare qualunque segnale di tipo aspecifico.

VALIDAZIONE DEL METODO

Le prestazioni di un metodo analitico possono essere definite attraverso una serie di grandezze: •

Accuratezza • Precisione • Specificità/selettività • Intervallo di linearità • Limite di rilevabilità (LOD)

• Limite di quantificazione (LOQ) • Robustezza (Robustness) • Solidità (Ruggedness)

Accuratezza

Concordanza del risultato ottenuto in un’analisi con il valore accettato come “vero” (valore di

riferimento dello standard a concentrazione nota). E’ espressa in termini di errore relativo , una %

inferiore a 3-4 è accettabile per l’errore relativo .

L’accuratezza di un metodo analitico spesso varia in funzione della concentrazione dell’analita.

L’accuratezza tende ad essere più bassa per concentrazioni nella parte bassa della retta di calibrazione

perchè l’errore è più elevato mentre si affievolisce nella parte centrale , potrebbe aumentare nella

parte alta a causa di altri fenomeni che alterno . Per definire meglio le caratteristiche di un metodo

queste grandezze vengono spesso determinate per tre concentrazioni diverse di analita (“bassa”,

“media”, “alta”) comprese nell’intervallo di analisi . Si preparano quindi 3 soluzioni standard a 3

concentrazioni definite . Si esegue analisi e determinazione della retta di calibrazione per verificare

poi l’analita alle 3 concentrazioni .

Il recupero fa riferimento all’accuratezza di un metodo estrattivo . Indica la % di analita che il

metodo estrattivo permette di recuperare anche in questo caso lo si determina usando una soluzione a

concentrazione nota .

Un metodo può essere scarsamente accurato ma poco preciso e viceversa ( è meglio avere un metodo

poco preciso ( significa che bisogna ripeterlo per un numero di n più elevato ) ma molto accurato

(vicino al valore vero)

La precisione esprime la riproducibilità dei risultati ottenuti da una serie di misure ripetute dello

stesso campione ( ci informa sulla concordanza dei dati ). Viene espressa attraverso deviazione

standard della media di ogni singola sessione (n iniezioni ) deviazione standard relativa, coefficiente

di variazione, ottenute effettuando analisi ripetute dello stesso campione.

Ripetibilità (precisione intra-assay). Viene definita come la riproducibilità di una serie di analisi

effettuate in un breve periodo di tempo (replicati). Si prepara una soluzione a concentrazione nota con

lo standard e si va a effettuare analisi di questa soluzione n volte in 3 distinte sessioni di analisi

nell’arco della stessa giornata e poi si calcola la deviazione standard della media di ogni singola

sessione per verificare la variabilità . Quindi ci mostra un dato che è simile a se stesso

indipendentemente dalla T nel laboratorio nell’arco della giornata .

Riproducibilità (precisione inter-assay): è la precisione di una serie di misure effettuate con lo stesso

metodo analitico, ma in momenti differenti ( tre giorni successivi ) . In genere è più difficile

mantenere la costanza delle variabili sperimentali su di un lungo arco di tempo. E’ più facile avere una

maggiore variabilità nella Riproducibilità rispetto alla Ripetibilità.

Una scarsa precisione è correlata agli errori casuali in eccesso o in difetto ( se si è precisi la gaussiana

degli errori è molto stretta ) . Un problema di accuratezza è legato ad un errore sistematico , errori

vicini ma lontani dal valore vero ( errore di pesata , bilancia scalibrata , preparando la soluzione stock