Analisi genetiche

Analisi complementazione:

È necessario un saggio fenotipico, viene ripristinato fenotipo wild type da due cell che presentano due mutazioni diverse (ad es mutato gene A aaBB e mutato gene B Aabb, incrociandosi producono AaBb che non presenta la malattia)

• Applicazioni:
• Presenza eterogeneità
• Clonaggio funzionale
• Patogenicità di una variante missense

Per trovare mutazione geniche

Screening di mutazioni:

L'indagine si svolge sul DNA nelle zone esoniche e nelle 2 zone introniche fiancheggianti. Con PCR produco milioni di campioni e successivamente faccio sequenziamento Sanger o NGS

Sanger:

Sequenzia un frammento alla volta

NGS:

Sequenzia tantissimi frammenti in parallelo

• Applicazioni:
• WGS: whole genome sequencing
• WES: whole exome sequencing
• analisi trascrittoma, epigenomica, metagenomica

Nel clonaggio funzionale applicazioni per

• malattie mendeliane rare con pochi casi
• casi sporadici con mut de novo
• malattie eterogenee (non posso fare linkage)
• integrazione a studi di una regione candidata

Per capire se una variante ha effetto patogenetico:

1. Segregazione della famiglia: se un individuo malato nella famiglia presenta variante missense, anche gli altri malati devono averla e i sani no, secondo le modalità di trasmissione ereditaria.
2. Conservazione dell'amminoacido durante l'evoluzione
3. Rarità della variante: se è comune non la considero
4. Programmi predittivi
5. Studi funzionali in vitro

Per genotipizzare un locus: pcr–analisi sequenza x SNP, digestione con enzimi di restrizione con elettroforesi x RFLP, elettroforesi capillare x microsatelliti

Per genotipizzare più loci: o SNP array o NGS genoma o esoma

• Applicazioni dei polimorfismi:
• costruire aploptico
• analisi linkage (per localizzare geni malattia in malattie medeliane)
• studi di associazione (per malattie multifattoriali)

Analisi del cariotipo:

Faccio una coltivazione cellulare in terreno PHA (mitogeno che stimola linfociti T) per indurre divisione in fase mitosi. Eseguo un prelievo di sangue periferico in eparina. Blocco divisione in metafase con COLCHICINA (impedisce formazione fuso mitotico). Lisi cellulare e colorazione. Bande G R Q C

Per alterazione di numero o struttura maggiore di 5 mb

Analisi complementazione:

È necessario un saggio fenotipico, viene ripristinato fenotipo wild type da due cell che presentano due mutazioni diverse (ad es mutato gene A aaBB e mutato gene B Aabb, incrociandosi producono AaBb che non presenta la malattia)

• Applicazioni:
• Presenza eterogeneità
• Clonaggio funzionale
• Patogenicità di una variante missense

Per trovare mutazione geniche

Screening di mutazioni:

L’indagine si svolge sul DNA nelle zone esoniche e nelle 2 zone introniche fiancheggianti. Con PCR produco milioni di campioni e successivamente faccio sequenziamento Sanger o NGS

Sanger:

• Sequeniza un frammento alla vota

NGS:

• Sequeniza tantissimi frammenti in parallelo
• Applicazioni:
• WGS: whole genome sequencing
• WES: whole exome sequencing
• analisi trascrittoma, epigenomica, metagenomica

Nel clonaggio funzionale applicazioni per

• malattie mendeliane rare con pochi casi
• casi sparodici con mut de novo
• malattie eterogenee (non posso fare linkage)
• integrazione a studi di una regione candidata

Per capire se una variante ha effetto patogenetico:

1. Segregazione della famiglia: se un individuo malato nella famiglia presenta variante missense, anche gli altri malato devono averla e i sani no, secondo le modalità di trasmissione ereditaria.
2. Conservazione dell’aminoacido durante l'evoluzione
3. Rarità della variante: se è comune non la considero
4. Programmi predittivi
5. Studi funzionali in vitro

Per genotipizzare un locus: pcr—analisi sequenza x SNP, digestione con enzimi di restrizione con elettroforesi x RFLP, elettroforesi capillare x microsatelliti

Per genotipizzare più loci: o SNP array o NGS genoma o esoma

• Applicazioni dei polimorfismi:
• costruire aplotipo
• analisi linkage (per localizzare geni malattia in malattie medeliane)
• studi di associazione (per malattie multifattoriali)

Analisi del cariotipo:

Faccio una coltivazione cellulare in terreno PHA (mitogeno che stimola linfoiciti T) per provocare divisione e bloccare in mitosi. Eseguo un prelievo di sangue periferico in eparina. Blocco divisione in metafase con COLCHICINA (impedisce formazione fuso mitotico). Lisi cellulare e colorazione. Bande G R Q C

Per alterazione di numero e struttura maggiore di 5 mb

Per anomalie cromosomiche minori di 5 mb

FISH

Consete di vedere quante copie ci sono di quel locus in una regione. Delezioni, duplicazioni e aneuploidie

Si basa su un uso di un sistema di ibidazione Creo una sonda specifica per la regione deleta e una per identificare il cromosoma. Se la sonda per localizzare la delezione si lega a quella di controllo non c'è la delezione. Limite: devo sapere cosa cercare. Se ho un sospetto.

CGH array:

Quando si vuole capire se ci sono CNV, duplicazioni o delezioni in tutto il genoma ovvero Comparative Genome Hybridization, è una tecnica che si basa sull'ibridizzazione competitiva di migliaia di frammenti di DNA in un cip, all’interno del quale c’è tutto il nostro genoma. Si usano 2 dna-comparative L dna di controllo viene colorato di verde, quello del pz di rosso: qualora la quantità di rosso e verde è uguale allora non sono presenti duplicazioni o delezioni.

In presenza di inversioni si chiede cgh array ma solo analisi cariotipo

SNP array:

Comparazione dell'intensità di segnale del campione con il valore medio di intensità di un campione controllo, una deviazione dell'intensità rivela una variazione del numero di copie La reazione avviene in un chip. Non si analizza crom Y, per le regioni satellitte dei cromosomi acrocentrici (13, 14, 15, 21, 22) Il software elabora due valori: BAF e LogRatio Nella condizione normale CNV=2 (Copy Number Variation) posso avere tre genotipi per ciascun locus: AA, AB, BB. Log ratio: LRR è il logaritmo in base 2 del rapporto dell’intensità del segnale fornito dall’allele A che la macchina osserva rispetto a quella attesa per ciascun locus, sempre 2.

X identificare geni che causano malattie genetiche:

Clonaggio funzionale:

Trasfezione delle celluledi pz con una libreria di cDNA, selezione cellule per reversione del fenotipo (in qualche cella entra gene corretto che complementa), sequenziamento del plasmide e analisi di sequenza nelle famiglia Limite: serve saggio funzionale (fenotipo che permetta di distinguere normale da malato)