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Procedura per l'estrazione delle proteine da tessuti archiviati

Nel caso in cui si parta da dei tessuti che sono stati oggetto di una fissazione molto lunga, da tessuti archiviati per molto tempo o da tessuti in cui la deparafinizzazione o il lavaggio non sono stati effettuati correttamente (in genere non sono corretti se avvengono troppo velocemente), è possibile che la resa finale dell'estrazione risulti molto bassa.

In alternativa all'utilizzo di kit commerciali è possibile effettuare anche un'estrazione delle proteine contenute in un tessuto d'archivio mediante l'utilizzo di reagenti normalmente presenti in laboratorio:

  1. Dopo deparafinizzazione e lavaggio in etanolo pongo la sezione di tessuto in Laemmli buffer (soluzione a base di Tris-HCl contenente glicerolo, SDS, β-mercaptoetanolo e il colorante blu dibromofenolo) per circa 20 minuti ad una temperatura di circa 100°C
  2. Pongo la provetta contenente il buffer e il campione in ghiaccio per 5 minuti
  3. Effettuo centrifugazione della provetta a 14.000 g per 10 minuti a 4°C
  4. Prendo il supernatante e lo trasferisco in un nuovo tubo
  5. Il campione è ora pronto per l'analisi delle proteine

provetta• Estraggo il sovranatante

Nel caso si abbiano a disposizione dei tessuti d’archivio fissati mediante l’utilizzo di fissativi alcolici è anche possibile effettuare un’estrazione alternativa in cui inizialmente si effettua sempre la deparafinizzazione e il lavaggio in alcoli ma poi si utilizza un buffer più blando (non contiene SDS ma contiene dei detergenti) combinato a degli inibitori di proteasi e poi si effettua una centrifugazione ed estrazione del surnatante.

Analisi di proteine ottenute da tessuto d’archivio

Le proteine isolate a partire da un tessuto d’archivio (fissato ed incluso) sono rappresentate da molecole denaturate su cui non è possibile effettuare dei saggi enzimatici per la valutazione dell’attività proteica; essenzialmente è possibile effettuare delle analisi per valutare la loro presenza nel campione mediante diverse tecniche (gran parte di esse prevedono l’impiego di anticorpi).

  1. Saggi colorimetrici:
    • Metodo BCA
    • Saggio Lowry
    • Saggio Bradford
  2. Saggi non colorimetrici:
    • Valutazione dell'assorbanza della soluzione a 280nm
Entrambe le tipologie di saggi si basano sulla legge di Lambert-Beer per il calcolo della concentrazione delle proteine presenti nell'isolato; secondo tale legge.l’assorbanza del campione risulta direttamente proporzionale alla concentrazione di proteine al suo interno. I saggi colorimetrici sono caratterizzati da un’elevata sensibilità (in quanto il coefficiente di estinzione molare ε è particolarmente grande) ma necessitano di effettuare delle analisi multiple del campione progressivamente diluito, in modo da ottenere un risultato maggiormente attendibile (ciò viene fatto in quanto la proporzionalità diretta tra assorbanza e concentrazione proteica persiste sino ad un massimo di concentrazione proteica oltre al quale tale proporzionalità viene meno). Il metodo di Warburg e Christian è una metodica di saggio non colorimetrico in cui la stima della concentrazione proteica viene effettuata sulla base della quantità di amminoacidi presentanti gruppi aromatici (fenilalanina, triptofano e tirosina) presenti all’interno dell’estratto proteico; siccome il contenuto di tali amminoacidi è direttamente proporzionale alla concentrazione proteica, è possibile stimare la concentrazione proteica totale del campione.amminoacidi può essere diverso da proteina a proteina la stima di questi non consente unavalutazione precisa della quantità di proteine. Un’ulteriore problema del metodo WC consiste nel normalemassimo assorbimento degli amminoacidi non aromatici; gli amminoacidi non aromatici presentano unmassimo di assorbimento attorno a 260nm, tuttavia assorbono in parte anche a 280nm alterando cosìl’analisi degli aromatici. Per poter ridurre l’errore nella stima della concentrazione proteica attraverso ilmetodo WC (essenzialmente arginare il problema dell’assorbimento parziale degli amminoacidi nonaromatici a 280nm), è necessario effettuare un calcolo dell’assorbanza del campione a 280nm e a 260nm inmodo poi da poter utilizzare i valori ottenuti per l’applicazione di tale formula:I vantaggi del metodo WC consistono tuttavia nella velocità della tecnica e nella possibilità di applicarlasenza alterare il campione (posso poi

Il saggio Lowry, così come gli altri saggi colorimetrici per la quantificazione proteica, si basa sulla reazione del biureto che si basa sull'utilizzo di urea (interagendo con residui amminoacidici forma dei legami amminici) e un agente di riduzione come reagenti. Il saggio prevede la quantificazione degli ioni rame ridotti in soluzione a seguito della reazione dell'urea con i gruppi amminici delle proteine; ad oggi esistono numerosi kit adatti allo sviluppo di tale saggio (essi si differenziano per alcuni reagenti utilizzati) in modo da poter scegliere il kit più corretto sulla base della modalità di fissazione ed inclusione del tessuto utilizzato per l'estrazione delle proteine.

Il metodo BCA è un metodo che prevede l'utilizzo dell'acido bicinconinico ed è basato sulla reazione di biureto e riduzione di ioni rame in soluzione; la valutazione del quantitativo proteico (esattamente come per il)

Lowry) viene effettuata mediante l'osservazione dell'assorbanza del campione a <562nm> inquanto a seguito della reazione di biureto si ha lo sviluppo di colore. Il saggio di prevede la reazione delle proteine in soluzione con il colorante blu di Comassi che si libera in soluzione presenta un massimo di assorbimento a <465nm> (è di colore rosso) mentre se legato a residui proteici presenta un massimo di assorbimento a <595nm> (è di colore blu); la tecnica prevede essenzialmente la misura multipla dell'assorbimento del campione (diluito a diverse concentrazioni) a <595nm> (l'intensità del blu è tanto maggiore quanto maggiore è la concentrazione della proteina in soluzione). Per questa tecnica è prevista la creazione di una retta di taratura mediante lo sfruttamento di (si effettua il saggio su soluzioni a concentrazione diversa di BSA così da ottenere la curva da usare per la determinazione della concentrazione).della proteina di interesse in soluzione) anche se talvolta essa può presentare una affinità diversa, rispetto alle proteine di analisi, per il blu di Comassi. Diversamente da quanto detto finora, la quantificazione immunometrica di un estratto proteico ottenuto da un tessuto fissato ed incluso può essere effettuata mediante: - SDS-page seguito da Western Blot; - Dot Blot proteici; - Saggi proteici in fase inversa (reverse phase protein arrays). Nel caso del Western Blot, solitamente si procede effettuando una corsa dell'isolato proteico su gel di acrilamide (a seconda della concentrazione di poliacrilamide del gel varia il range del peso molecolare delle proteine separabili) in modo da effettuare una separazione iniziale delle proteine sulla base del loro peso molecolare (le proteine possono essere evidenziate nel gel mediante colorazione di questo attraverso l'utilizzo di Comassi blu) per poi effettuare il WB (bisognerà effettuare un

trasferimento delle proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa); in alternativa è possibile effettuare già inizialmente il trasferimento delle proteine sul supporto solido (membrana di nitrocellulosa) per poi effettuare bloccaggio dei siti specifici della membrana (si utilizzano soluzioni ottenute da latte in polvere), decorazione delle proteine con anticorpi primari, lavaggio degli anticorpi in eccesso, coniugazione con anticorpo secondario marcato (con perossidasi o fosfatasi alcalina), lavaggio degli anticorpi in eccesso e quantificazione delle proteine a seguito dell'aggiunta del substrato enzimatico (si ha una reazione colorimetrica). Il trasferimento delle proteine dal gel di poliacrilamide al supporto solido (in modo da effettuare il WB) può avvenire attraverso l'impiego dei metodi:

  • Wet; il trasferimento è verticale ed avviene mediante l'impiego del buffer di trasferimento (Tris glicina in presenza di metanolo).
  • Semidry;

Il trasferimento avviene orizzontalmente. Ad avvenuto trasferimento si può verificare che esso sia avvenuto correttamente mediante colorazione con rosso Ponceau allo 0.2% in soluzione acquosa di acido tri-cloro-acetico (la colorazione avviene a temperatura ambiente e necessita pochi minuti); dopo l'utilizzo del colorante si effettua un lavaggio in acqua e si osserva se vi è la presenza di bande sulla membrana (se ci sono allora il trasferimento è avvenuto correttamente). A seguito della colorazione si prosegue con la decorazione mediante l'impiego di anticorpo primario a temperatura ambiente (poi si procede con lavaggio, uso di anticorpo secondario e successivo ulteriore lavaggio). Lo stripping della membrana (procedimento mediante cui si può "spogliare" la membrana dagli anticorpi primari e secondari alla fine del WB così da poter rieffettuare la procedura 31 andando però ad investigare su un'altra proteina mediante

L'impiego di un diverso anticorpo primario viene effettuato in marcaptoetanolo in presenza di buffer Tris (a pH debolmente acido) ed SDS; la procedura prevede il riscaldamento della membrana a 50°C seguito dal lavaggio della membrana con TBS e blocco dei siti aspecifici. La rilevazione colorimetrica per la quantificazione della proteina di interesse viene effettuata sfruttando l'enzima perossidasi (il suo substrato viene convertito in un prodotto color viola che precipita a livello della zona della membrana dove è presente la proteina di interesse) o fosfatasi alcalina (anche in questo caso viene convertito un substrato in un prodotto colorato ma la reazione può protrarsi per tempi più lunghi). Il WB permette di valutare la specificità di un anticorpo (se nella soluzione infatti ho una proteina di cui conosco il peso molecolare, so che l'anticorpo in questione dovrebbe legare la proteina formando una banda visibile sulla nitrocellulosa in una

data posizione); nel caso in cui la specificità dell'anticorpo sia massima, vi è la possibilità di effettuare un passaggio delle proteine sulla superficie solida senza la necessità di una precedente corsa per la separazione.
Dettagli
Publisher
Ticio
A.A. 2019-2020
55 pagine
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SSD Scienze biologiche BIO/11 Biologia molecolare
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Ticio di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biomarcatori molecolari nei tessuti e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli Studi di Trieste o del prof Biologia Prof.