Analisi di biomarcatori tissutali in clinica

Appunti di biomarcatori molecolari nei tessuti

Capitolo 1 – Condizioni preanalitiche

Ad oggi pochi biomarcatori normalmente utilizzati o studiati in ambiti di ricerca vengono utilizzati anche in ambito clinico; ciò si ritiene sia dovuto ad una irriproducibilità dei metodi della ricerca nella clinica. I metodi utilizzati nella ricerca e quelli utilizzati nella clinica differiscono essenzialmente a causa di:

• Condizioni preanalitiche dei tessuti e delle biomolecole analizzate (determinano un grosso range di variabilità in quanto molto diverse nei 2 settori)
• Eterogeneità dei tessuti utilizzati (a livello clinico, morfologico e molecolare)
• Selezione e standardizzazione delle procedure analitiche in ambito clinico/diagnostico

Le condizioni preanalitiche sono estremamente importanti nell’analisi di campioni in laboratorio in quanto queste possono influenzare pesantemente i risultati dell’analisi; queste condizioni sono molte e determinano la qualità del campione di analisi sia nella diagnostica in vitro che della ricerca (proprio per questo risulta estremamente importante che le condizioni preanalitiche risultino le migliori possibili così da garantire la qualità più elevata possibile del campione).

Per il confronto di risultati ottenuti da un campione mediante l’applicazione su di esso di una certa metodica di ricerca o di diagnosi risulta particolarmente importante, oltre alla miglior qualità delle condizioni preanalitiche, anche la loro uguaglianza di qualità all’interno delle diverse strutture.

Il rispetto delle corrette condizioni preanalitiche risulta estremamente importante in ambito clinico/diagnostico in quanto i medici, in molti casi, si affidano ai risultati dei test di laboratorio per la diagnosi e la terapia guida (oltre il 70% delle decisioni cliniche si basa su informazioni derivate dai risultati di laboratorio); a tal proposito ad oggi circa il 60/70% dell’ammontare totale di errori nelle pratiche analitiche di laboratorio è dovuto ad una incorretta condizione preanalitica di partenza per l’analisi.

La fase preanalitica copre tutti i passaggi che vanno dalle richieste del medico all'inizio dell'esame analitico e sono comprese le estrazioni di acido nucleico o di proteine. I fattori che possono influenzare le condizioni preanalitiche consistono essenzialmente in:

• Fattori biologici; ossia fattori inerenti alla natura del paziente (digiuno al momento del prelievo, fumatore, indice di massa corporea, etc)
• Fattori ambientali; ossia la temperatura ambientale alla quale avviene l’analisi
• Fattori tecnici; questi comprendono la procedura di raccolta del campione (prelievo ematico, etc), modalità di trasporto del campione, suo processamento finale e sua conservazione

L’isolamento di un acido nucleico o di una proteina consiste in un processo che fa parte anch’esso delle condizioni preanalitiche in quanto l’estrazione è caratterizzata dal susseguirsi di numerosi processi fonte ognuno di variabilità; avremo quindi che la qualità finale dell’isolato dipenderà da come è stata redatta la procedura e per tanto tale qualità potrebbe variare da struttura a struttura sanitaria.

Standardizzazione delle condizioni preanalitiche

La standardizzazione delle condizioni preanalitiche risulta fondamentale al fine di garantire l’accuratezza e la riproducibilità dei risultati analitici; tali condizioni non dovrebbero risultare condivise unicamente tra la diagnostica e la ricerca ma anche con le biobanche (struttura che raccoglie in maniera organizzata materiale biologico utile per la ricerca clinica non ad uso clinico di trapianto) in modo da poter fornire dei campioni di elevata qualità. La non condivisione di standard preanalitici da parte delle biobanche è facilmente evidenziabile effettuando delle analisi PCA (principal component analysis) prendendo in considerazione una particolare tipologia di campione derivata però da diverse biobanche (quello che sarà possibile osservare sarà che i campioni tenderanno a clusterizzare sulla base della biobanca di provenienza).

Lo standard consiste in un modello di riferimento al quale è doveroso conformarsi; tale modello consiste in un documento utilizzabile in diverse aree (nel caso di interesse uno standard dei processi analitici nella diagnostica in vitro) che stabilisce delle specifiche tecniche per la realizzazione di un prodotto o per la fornitura di un servizio adeguato. Tali documenti sono creati da organismi di normazione internazionali (CEN europeo e ISO internazionale) e controparti nazionali (UNI nel caso dell’Italia).

Il progetto che inizialmente ha permesso la realizzazione di questi standard è stato SPIDIA ad oggi rinnovato nella veste di SPIDIA4P che si prefigge anche l’obbiettivo di creare dei programmi di valutazione esterna di qualità (in inglese VEQ) per il confronto interlaboratorio allo scopo del miglioramento continuo della qualità. Attraverso un apposito sito i singoli laboratori possono procedere ad una autovalutazione della modalità con la quale viene effettuata una specifica analisi (si procede alla compilazione di un questionario e poi si attende una risposta dall’ente che consiste nella valutazione di come il laboratorio processa il campione per la particolare analisi) ed eventualmente decidere di rendere pubblico il risultato della valutazione così da testimoniare la propria bontà di lavorazione.

Nella qualità del campione d’analisi in diagnostica, avremo che le condizioni preanalitiche incidono molto (per questo occorre che esse vengano standardizzate) ma molta della variabilità in termine di qualità del campione analizzato è dovuta alla biologia stessa del campione ossia alla eterogeneità del campione.

Modificazione delle condizioni preanalitiche

Le condizioni preanalitiche possono venir essenzialmente modificate attraverso:

• Processi tecnologici; al fine di migliorare costantemente la qualità del campione attraverso l’applicazione sul campione delle procedure e tecniche migliori e maggiormente innovative per la sua trattazione
• Impiego di standard internazionali per il flusso preanalitico; ciò è condiviso dalle biobanche (al fine di fornire campioni di alta qualità), dalla ricerca biomedica e traslazionale (per effettuare corrette ricerche in ambito accademico o industriale) e nella diagnostica (per ottenere dati di elevata qualità dalle analisi e per ottenere dati indipendenti dalla struttura sanitaria di origine)

Capitolo 2 – Biomarcatori

Il National Cancer Institute definisce come biomarcatore “una molecola biologica trovabile nel sangue o in altri liquidi biologici o tessuti e rappresenta un segnale di un processo fisiologico o meno che avviene in risposta ad un intervento di qualsiasi natura incluso quello terapeutico”, pertanto il concetto di biomarcatore risulta estremamente vasto che include moltissime molecole utilizzabili per diverse finalità; alcuni biomarcatori possono venir utilizzati per stimare il rischio di sviluppare una certa patologia (ad esempio particolari mutazioni a livello del gene BRCA1 aumentano il rischio nell’individuo di sviluppare cancro alla mammella), alcuni a scopo di screening (PSA nei confronti del cancro alla prostata), a scopo diagnostico, a scopo prognostico, a scopo predittivo dell’effetto di una data terapia (l’osservazione di alcune mutazioni a livello del gene per KRAS in pazienti affetti da cancro al colon preclude la possibilità di sottoporsi a terapia anticorpale).

I biomarcatori vengono solitamente utilizzati per meglio inquadrare i singoli pazienti in modo da comprendere a quale gruppo essi appartengano così da sottoporli poi alla migliore terapia possibile; questo rappresenta il concetto di medicina di precisione (ad oggi ci si basa comunque molto su dei protocolli generali in quanto i mezzi utilizzabili per la medicina di precisione ad oggi risultano scarsamente sostenibili nell’ambito clinico).

I biomarcatori possono venir classificati sulla base della molecola in esame:

• DNA; su di esso è possibile ricercare alcune particolari mutazioni della sequenza nucleotidica o alterazioni epigenetiche
• RNA; utilizzabile per la ricerca del profilo di espressione genica o per la ricerca dell’espressione di particolari ncRNA (come i microRNA che risultano estremamente conservati)
• Proteine; utilizzabili per un’analisi quantitativa delle condizioni dei pazienti

Possono alternativamente venir suddivisi sulla base del loro impiego (il biomarcatore può risultare talvolta di più tipologie contemporaneamente):

• Biomarcatore di suscettibilità o rischio; se indica la potenzialità di un soggetto di sviluppare una patologia o una condizione medica particolare (la suscettibilità è un concetto applicabile solamente su pazienti che non presentano una evidenza clinica della patologia) come APOE nel caso del morbo di Alzheimer
• Biomarcatore diagnostico; viene utilizzato per rilevare o confermare una malattia o condizione di interesse (come ad esempio la glicemia o l’emoglobina glicata, utilizzabili entrambe per definire i soggetti affetti da diabete di tipo 2)
• Biomarcatori di monitoraggio; utilizzabili per la misurazione seriale dello stato di salute del paziente (ad esempio il Ca125 nei pazienti affetti da cancro alle ovaie)
• Biomarcatori prognostici; permettono di comprendere la probabilità che si realizzi un determinato evento clinico (recidiva, progressione, etc) in pazienti che in precedenza hanno avuto una diagnosi positiva per una certa patologia
• Biomarcatore predittivo; viene utilizzato al fine di identificare individui che possano rispondere positivamente a particolari trattamenti
• Biomarcatore di risposta/farmacodinamica; utilizzabili per la valutazione della risposta ad un trattamento (ad esempio l’emoglobina glicata può venir utilizzata per valutare se il trattamento antiglicemico sta funzionando nel paziente diabetico)
• Biomarcatori di sicurezza; essi vengono misurati prima/dopo un trattamento per verificare lo stato di salute generale di un paziente (ad esempio la conta dei neutrofili è utilizzabile per comprendere se un paziente può essere sottoposto ad un ciclo di chemioterapia)

Quando può venir utilizzato un biomarcatore

Una molecola può venir utilizzata come biomarcatore innanzitutto quando vi è stata una previa scoperta che la molecola risulta in relazione con un outcome clinico (prognostico, predittivo, etc); tale informazione deriva dalla ricerca clinica. Successivamente alla scoperta vi deve essere una ottimizzazione del saggio analitico per la molecola mediante la definizione di cosa utilizzare per l’analisi della molecola (tessuto ottenuto da biopsia, saliva, siero, etc) e poi occorre procedere con l’acquisizione di una serie di validazioni (tecniche, cliniche e di utilità nel suo utilizzo).

Nel parlare di validazioni tecniche bisogna far riferimento anche alla validità analitica ossia quanto accuratamente il saggio riesce a rilevare l’analita di interesse e con quale sensibilità e riproducibilità (se il saggio non risulta riproducibile e quindi il rieffettuare l’analisi del marcatore fornisce un risultato diverso, tale saggio non può venir utilizzato), mentre per una validazione clinica vi è la necessità che il risultato ottenuto dall’analisi corrisponda alla realtà del paziente facendo riferimento alla sensibilità e specificità del test. Per la validazione di utilità è necessario che il marcatore presenti un valore aggiunto rispetto ad altri marcatori utilizzati allo stesso scopo (se non presenta tale valore aggiunto non verrà impiegato nella pratica clinica).

Eterogeneità tumorale

Come detto in precedenza, l’irriproducibilità della ricerca clinica nella pratica diagnostica risulta essenzialmente dovuta a fattori tecnici (condizione preanalitiche diverse nella ricerca rispetto alla diagnostica e diverse modalità di analisi utilizzate) e biologici (legati alla diversità dei pazienti nella diagnostica) che nel complesso determinano la differenza esistente tra i due ambiti; nel caso particolare del cancro un fattore biologico molto importante nel determinare la differenza esistente tra diagnostica e ricerca clinica consiste nell’eterogeneità del tumore.

L’eterogeneità nell’ambito del tumore va tenuta profondamente in considerazione per lo sviluppo di biomarcatori tumorali; essa è legata a molteplici aspetti e per tanto potremmo definire diverse tipologie di eterogeneità:

• Eterogeneità clinica; essa è legata alla natura del paziente (età, sesso, stile di vita, etc)
• Eterogeneità tissutale; essa è legata alla condizione del tessuto neoplastico (livello di infiammazione, di necrosi e quantità di tessuto normale) e all’istologia (vi è la possibilità che tumori dello stesso tipo presentino differenze nell’istologia tali da determinare i sottotipi tumorali)
• Eterogeneità molecolare; comprende l’eterogeneità clonale (essa comprende l’eterogeneità genetica ed epigenetica) e quella fenotipica (dovuta alle diverse modalità possibili di iterazione delle cellule tumorali tra loro e con l’ambiente circostante)

L’eterogeneità tissutale o morfologica può essere apprezzata disponendo di un prelievo bioptico normalmente utilizzato per la valutazione dei margini della lesione una volta che il prelievo stesso è stato sottoposto a micro-dissezione (effettuata allontanando il tessuto normale); sottoponendo il campione ad un’analisi molecolare si potrà osservare un diverso profilo di espressione delle cellule tumorali a seconda delle cellule usate per l’analisi (ad esempio appartenenti ai bordi del campione o al suo centro) così come sottoponendo diversi campioni all’analisi si potranno osservare profili diversi a seconda del tessuto colpito, della reazione del tessuto al tumore, etc. L’insieme di tali diversità fa si che andando ad effettuare un’analisi di un biomarcatore all’interno di una massa tumorale, il risultato possa essere profondamente diverso a seconda delle cellule utilizzate per l’analisi (appartenenti al centro o ai bordi del campione), proprio per questo risulta importante stabilire dove bisogna effettuare sempre l’analisi all’interno del campione così da permettere la riproducibilità della stessa.

L’eterogeneità molecolare solitamente fa riferimento a quella intra-tumorale e non a quella inter-tumorale che riguarda le differenze esistenti tra colonie diverse dello stesso tumore (a seguito di metastasi); dell’eterogeneità molecolare fa parte quella clonale e quella non clonale. L’eterogeneità clonale può essere apprezzata a seguito dei risultati ottenuti da tecniche di sequenziamento applicate a cloni cellulari diversi, in quanto dai risultati potrò osservare differenze genetiche così come a livello della regolazione epigenetica che potranno compromettere l’analisi di alcuni biomarcatori. L’eterogeneità epigenetica nel tumore è dovuta soprattutto al differente stato di metilazione del DNA nelle diverse cellule tumorali, anche se esse tendono comunque ad uno stato di ipometilazione generale (l’ipometilazione infatti è maggiormente associata al tumore), e alla deacetilazione o alla metilazione di istoni capaci di silenziare geni oncosoppressori. L’eterogeneità molecolare è comunque legata sia allo spazio (le cellule di un tumore primitivo saranno diverse dal punto di vista genetico ed epigenetico da quelle di una colonia metastatica) che al tempo (col tempo e la resistenza alle terapie a cui viene sottoposto il tumore questo va in contro ad alterazioni progressive) ed aumenterà con l’aumentare di entrambe le variabili.

Nel determinare l’eterogeneità non clonale partecipa invece:

• La plasticità stocastica; osservabile ad esempio dall’anatomopatologo in cellule apparentemente uguali ma con capacità proliferativa diversa a causa di una diversa attivazione (attribuibile al caso) di fattori di regolazione nella cellula;
• La plasticità fenotipica funzionale; ossia la capacità delle cellule tumorali nell’adattare il proprio fenotipo a seconda delle richieste ambientali (ad esempio l’espressione di HIF1α da parte di cellule neoplastiche in condizione di ipossia);
• Il microambiente tumorale; esso può variare da tumore a tumore a seconda del tessuto o dell’organo interessato e può agevolare lo sviluppo di un particolare fenotipo tumorale piuttosto che di un altro;

Terapia mirata nel cancro

L’applicazione di terapie mirate (un tipo di terapia farmacologica per la cura dei tumori indirizzata a contrastare i meccanismi specifici del processo di carcinogenesi dei singoli tumori) in pazienti affetti da diverse forme di cancro (ad esempio melanoma metastatico) ha permesso l’aumento della loro aspettativa di vita; l’applicazione di queste forme di terapie richiede l’analisi nell’individuo di svariati biomarcatori molecolari così da caratterizzare al meglio la patologia, accertarsi preventivamente se l’utilizzo di un determinato farmaco può ritenersi utile e comprendere quali farmaci possano venir somministrati dato il costo elevato di tali terapie (ad oggi in Italia i pazienti vengono trattati con tali farmaci solo nel caso in cui non rispondano alla chemioterapia dato il costo elevato di questi farmaci). Un esempio di biomarcatore predittivo analizzato in pazienti affetti da cancro colico così da comprendere se potrebbe risultare utile la somministrazione di anti-EGFR consiste in mutazioni del gene KRAS.

Una controindicazione data dall’utilizzo di farmaci per terapie mirate al cancro consiste nella veloce resistenza acquisita dalle cellule tumorali (molto spess...