9. Analisi enzimisi e isoenzimi (generalita', cinetica di Michaelis Menten, tecniche per determinare la presenza di enzimi in un campione)

Come fare per capire se in un campione è presente un enzima? - Principio di visualizzazione enzimatica

Per verificare la presenza di un enzima in un campione biologico si procede aggiungendo al campione in esame una soluzione contenente un substrato enzima specifico. La dimostrazione della presenza dell'enzima ricercato viene ottenuta se l'azione catalitica dell'enzima sul substrato produce un prodotto di reazione colorato. Spesso, tuttavia, la reazione tra enzima e substrato produce un prodotto incolore. Per questo motivo si ricorre a un secondo enzima, che, interagendo con il prodotto della reazione primaria, sviluppa una caratteristica colorazione. Questa seconda reazione si dice reazione indicatrice.

Di visualizzazione degli enzimi - Metodi ossidativi

La presenza in un campione biologico di enzimi ossidativi, come le deidrogenasi, può essere rilevata facendo ricorso ai Sali di tetrazolio, che si colorano quando vengono ridotti. Si parla, quindi, di saggio del

SALE DI TETRAZOLIO PER LE DEIDROGENASI.

Questo saggio rileva la presenza delle deidrogenasi (in particolare della succinato deidrogenasi) e, di conseguenza, permette di valutare l'attività metabolica delle cellule (cioè la loro vitalità) dal momento che la succinato deidrogenasi è contenuta solo nei mitocondri delle cellule vitali. Questo enzima riduce il sale di tetrazolio MTT (sale di dimetil tiazolil difenil tetrazolo) a formazano, conferendo alla sostanza un colore blu violaceo.

Solitamente come donatore di idrogeno viene utilizzata la fenazina metosolfato. Quindi la deidrogenasi trasferisce l'idrogeno dalla fenazina all'MTT, causando la riduzione di quest'ultimo con sviluppo di una colorazione blu/viola.

Alcune ossidasi possono catalizzare reazioni che terminano con la produzione di perossido di idrogeno. Un esempio è la xantina ossidasi. Questo enzima catalizza la seguente reazione:

xantina + H2O + O2 ⇄ urato + H2O2

Per visualizzare la presenza dell'enzima si dovrà aggiungere l'aperossidasi e un donatore di idrogeno. Il donatore di idrogeno utilizzato in questo caso è il 3-amino-9-etilcarbazolo. L'aperossidasi, in presenza di un donatore, catalizza la seguente reazione: donatore + H2O2 ⇄ donatore ossidato + 2 H2O

Nel momento in cui il 3-amino-9-etilcarbazolo viene ossidato cambia colorazione (da giallo a marrone).

DI VISUALIZZAZIONE DELLE METODI IDROLASI

Tra i metodi più utilizzati per visualizzare gli enzimi idrolitici i più famosi sono:

L'uso di un substrato, come il 4-metil-umbelliferil-alpha-L-fucoside, che quando viene idrolizzato (a 4-metil-umbelliferone) diventa fluorescente.

Il METODO DI AZO-ACCOPPIAMENTO prevede l'utilizzo di derivati del naftolo come substrati. Ad esempio, viene utilizzato l'alpha-naftil-butirrato, che viene idrolizzato in presenza dell'enzima esterasi in alpha naftolo e acido butirrico. L'alpha naftolo che si

è formato è incolore e perquesto viene accoppiato a un sale di diazonio (ad esempio, ilFast Blue RR). Attraverso una reazione non catalizzata daenzimi, il naftolo e il sale di diazonio reagiscono a dare undiazocromoforo colorato.

Oppure si può utilizzare come substrato di partenza anche laL-leucine-beta-naftilammide, che in presenza di leucinaviene convertito, attraverso una reazione catalizzatadall’amminopeptidasi, in beta-naftolo e leucinamide. Ilbeta-naftolo viene accoppiato con un sale di diazonio (adesempio, il Fast Red TR) e, attraverso una reazione noncatalizzata da enzimi, interagiscono tra loro a formare un diazocromoforo.

METODI DI DETERMINAZIONEDELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

-DOSARE LA QUANTITA’ DI ENZIMA

Il controllo dell’attività enzimatica è molto importante in quanto illoro malfunzionamento o inattivazione può portare a diversepatologie. Ad esempio, la galattosemia è una condizionepatologica che si

presenta fin dall'età neonatale a causa di una mutazione del gene che codifica per l'enzima galattosio-1-fosfato-uridil-transferasi. Ne consegue un difetto del metabolismo del galattosio che può causare danni anche fatali (come nella galattosemia classica) o danni più lievi come la cataratta.

La quantità degli enzimi viene determinata in base alla loro attività catalitica. Innanzitutto, la quantità di un enzima può essere espressa come Unità Internazionale (U.I.), definita come la quantità di enzima che catalizza la trasformazione di 1 micromole di substrato in prodotto in 1 minuto, a 30°C o a 37°C, a pH ottimale, e in presenza di concentrazioni saturanti di substrato. Oppure, la quantità di enzima può essere espressa in Katal, definito come la quantità di enzima che trasforma 1 mole di substrato in 1 secondo, a 30°C o 37°C, e in presenza di concentrazioni saturanti di substrato. Se si

vuole dosare la quantità di enzima in un campione biologico, una volta che sia nota la sua specificità per un substrato e, quindi, la sua Km, si può risalire alla sua concentrazione mettendogli a disposizione un largo eccesso di substrato e determinando in un tempo stabilito quanto prodotto si è formato con procedimenti colorimetrici o spettrofotometrici. -61 U.I. = 1 micromole/min = 10 mol/min = 16,67 nmol = 16,67 nKat Si possono utilizzare due metodi per determinare la concentrazione di enzima: METODO DI MISURA IN CONTINUO - METODO DI MISURA A TEMPO FISSO Il metodo di misura in continuo si può effettuare quando è possibile seguire nel tempo la variazione di un parametro fisico o chimico-fisico, come l'assorbanza o la colorazione, del prodotto o del substrato. Esistono due metodi di misura in continuo: 1. Test ottico semplice (Warburg), che valuta la variazione di assorbanza del substrato e del prodotto. Ad esempio, nel caso degli enzimi trasportatori.

di idrogeni, come le deidrogenasi,essi possono catalizzare la reazione di ossidazione del NAD(P)HA NAD(P)+, o possono catalizzare la reazione di riduzione delNAD(P)+ a NAD(P)H. Il NAD(P)H assorbe a 340 nm, mentre ilNAD(P)+ assorbe a 260 nm (anche il NADP(H) assorbe a 260nm, oltre che a 340 nm) . Quindi in una reazione catalizzata dauna deidrogenasi in cui un substrato (A) viene ridottoacquistando ioni H+ ceduti dal NAD(P)H, formando un prodotto(B) ridotto e NAD(P)+ ossidato:

A + NAD(P)H + H → B + NAD(P) + 2H

Si osserva la conversione del NAD(P)H in NAD(P)+accompagnata da una riduzione di assorbanza a 340 nm. Cioè a una lunghezza d'onda di 340 nm si osserverà un minore assorbimento di luce man mano che si forma il prodotto.

2. Test ottico accoppiato. Alcune volte nessun composto della reazione è capace di assorbire. Per questo motivo si fa ricorso a una seconda reazione enzimatica per la quantificazione del primo enzima:

E1 + S → E1 + P (dove P è il prodotto)

non colorato o ⁺ E₂ Q + E₂ (dove Q è il prodotto colorato) → La prima reazione si dice reazione primaria, la seconda si dice reazione indicatrice. Utilizzando un dosaggio enzimatico continuo semplice si può risalire all'attività enzimatica (e, quindi, alla concentrazione dell'enzima). Ricordando che: 1 U.I. = 1 micromole di substrato trasformato/min = C/min Dove C = concentrazione di substrato. Con il test ottico continuo semplice si valuta l'assorbanza che è definita dalla legge di Lambert Beer come: A = ε * l * C Dove ε = coefficiente di assorbimento molare (unità: 1/M cm), dipende dal solvente, lunghezza d'onda utilizzata e dalla specie chimica che dà l'assorbimento; l = cammino ottico, ovvero lo spessore della soluzione contenuta nella cuvetta. Dalla legge di Lambert Beer si può ricavare la concentrazione C come: C = A / (ε * l) E, quindi, ΔC = ΔA / (ε * l) La variazione di

assorbanza viene direttamente misurata con il testottico semplice facendo una misura di assorbanza all'inizio e poi una 3 o 4 minuti dopo. Quindi:

1 U.I. = ΔC/min = ΔA/ ε*l*min

Tenendo conto del volume di campione usato per la prova e del volume totale di reazione, si ottiene la seguente formula:

1 U.I. (mUI/ml) = ΔA*V*1.000/ ε*l*min*v

Dove ΔA = variazione di assorbanza del NAD(P)H a 340 nm; 1.000 = fattore di conversione alle mUI (mille unità internazionali); V = volume totale della miscela di reazione (in ml); v = volume campione (in ml); l = cammino ottico. Normalmente i valori di l, V, v, 1000, ε sono costanti e sono indicati con K.

A loro volta, gli enzimi possono essere utilizzati per determinare la concentrazione di determinati metaboliti in un campione biologico. Data l'elevata specificità di un enzima per il suo metabolita, si può determinare la quantità di quest'ultimo all'interno del siero.

senzadover effettuare una preliminare deproteinizzazione. Per la determinazione della quantità di un determinato metabolita occorre un eccesso di enzima in modo che la reazione proceda abbastanza velocemente. Nel caso di reazioni reversibili l'equilibrio deve essere spostato a favore dei prodotti così che la reazione venga effettivamente completata. Un esempio di reazione reversibile è la reazione tra acido piruvico e NADH della fermentazione lattica: acido piruvico + NADH → acido lattico + NAD+ In questa reazione l'acido piruvico viene ridotto dal NADH ad acido lattico, mentre il NADH si ossida a NAD+. La reazione inversa prevede l'ossidazione dell'acido lattico e la riduzione del NAD+ a NADH. Consideriamo la reazione di ossidazione dell'acido lattico: acido lattico + NAD+ → acido piruvico + NADH Questa reazione è catalizzata dall'enzima lattato deidrogenasi (LDH). Per determinare la quantità di acido lattico presente nel sangue, sioncentrazione standard; Ac= assorbanza campione; As= assorbanza standard. Il testo formattato con i tag html sarà il seguente:

Aggiunge l'idrazina che, legandosi all'acido piruvico, evita che quest'ultimo possa essere riconvertito in acido lattico. Per conoscere, quindi, la concentrazione di un metabolita bisogna misurare l'assorbanza dello standard (cioè un campione di acido lattico, ad esempio, a concentrazione nota miscelato con il reagente, una soluzione di NAD+ e lattato deidrogenasi), quella del campione (campione di sangue, nel quale si vuole determinare la concentrazione di acido lattico, miscelato allo stesso reagente di prima) ed eseguire il seguente calcolo:

Cc = (Ac/As) x Cs

Dove Cc = concentrazione campione; Cs = concentrazione standard; Ac = assorbanza campione; As = assorbanza standard.