9. Analisi enzimisi e isoenzimi (generalita', cinetica di Michaelis Menten, tecniche per determinare la presenza di enzimi in un campione)

Gli enzimi

Generalità

Gli enzimi sono proteine che svolgono attività catalitica nei sistemi biologici, cioè innescano una reazione chimica. Da un punto di vista strutturale, gli enzimi sono proteine che presentano, nella maggior parte dei casi, una struttura quaternaria, in grado di legare una o più sostanze reagenti, dette substrati, catalizzandone la loro conversione. Non sempre gli enzimi hanno una struttura quaternaria, infatti in molti casi sono composti anche da un solo peptide e, quindi, sono dei monomeri. In alcuni casi, gli enzimi effettuano la catalisi autonomamente; in altri hanno bisogno dell’intervento di cofattori, cioè componenti addizionali di natura non proteica. I cofattori possono essere ioni metallici, come Ca²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, K⁺ ecc. o molecole organiche chiamate coenzimi, come il FAD, il flavin-mono-nucleotide (FMN), la biotina ecc. Questi coenzimi legano stabilmente, con legami covalenti, l’enzima. Ci sono anche coenzimi, detti coenzimi trasportatori, rappresentati da molecole organiche che legano reversibilmente l’enzima e, quindi, non sono parte integrante ma partecipano alla catalisi. Esempi di coenzimi trasportatori sono il NAD⁺, il coenzima-A, l’ADP, l’ATP. L’insieme di componente proteica (apoenzima) e di una parte non proteica (cofattore o coenzima) è detto oloenzima. Gli enzimi esclusivamente proteici sono detti oloproteine. Solitamente, i coenzimi partecipano ai processi di catalisi e senza di essi l’enzima non sarebbe in grado di innescare una reazione; in alcuni casi, però, il coenzima non partecipa alla catalisi ma serve a mantenere l’enzima in una conformazione che rende attivo l’enzima stesso e, quindi, in grado di catalizzare una reazione.

Gli enzimi, per poter funzionare, devono presentare le seguenti caratteristiche:

• Alla fine della reazione devono avere la loro struttura immodificata e pronta per riprendere l’attività catalitica;
• Essere efficaci in piccole quantità;
• Non devono influenzare l’equilibrio di una reazione chimica reversibile A + B ↔ C + D (30% ↔ 70%).

L'attività catalitica

In quanto catalizzatori, gli enzimi intervengono nelle reazioni, senza essere consumati, abbassando l’energia di attivazione, spesso notevolmente alta. L’energia di attivazione è una barriera energetica tra reagenti e prodotti che impedisce alla reazione di procedere in un arco di tempo compatibile con le esigenze e la sopravvivenza della cellula di un organismo vivente. Un enzima è in grado, quindi, di ridurre la forza di questa barriera in modo da rendere la reazione realizzabile.

Generalmente, la prima azione dell’enzima è quella di legarsi al substrato formando un complesso enzima-substrato (ES); in questo modo il substrato attivato reagisce dando origine ai prodotti della reazione (P), i quali abbandonano l’enzima che si trova così disponibile per legarsi ad altre molecole di substrato. L’energia di attivazione in una reazione catalizzata è più bassa di quella di una reazione non catalizzata perché l’enzima costringe i reagenti ad avvicinarsi.

Data una certa quantità di enzima, la velocità della reazione aumenta in modo quasi direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato in una prima fase, per poi raggiungere un valore massimo (V_max), che viene mantenuto nonostante si continui ad aggiungere substrato. Il raggiungimento della velocità massima è dovuto alla saturazione dei siti attivi delle molecole degli enzimi. Per questo motivo, la velocità massima è anche chiamata velocità di saturazione. Solo aumentando la quantità di enzima è possibile ottenere un ulteriore aumento della velocità, destinata anche in questo caso a raggiungere un valore massimo quando non ci saranno più siti attivi disponibili per legare le molecole di substrato.

La velocità V di una reazione catalizzata da un enzima viene espressa dall’equazione di Michaelis-Menten come:

V = V_max[S]/ (K_M + [S])

Dove K_M è la costante di Michaelis-Menten, che coincide numericamente con la concentrazione di substrato necessaria a raggiungere una velocità di reazione uguale alla metà di quella massima. Infatti, se considerassimo:

V = V_max/2

potremmo riscrivere l’equazione di Michaelis-Menten come:

V_max * (1/2) = V_max * ([S]/ (K_M + [S]))

Quindi si possono dividere entrambi i termini per V_max e si ottiene:

1/2 = [S]/ (K_M + [S])

Moltiplicando tutto per 2 si ottiene:

1 = 2[S]/ (K_M + [S])

Moltiplicando tutto per (K_M + [S]) si ottiene:

K_M + [S] = 2[S]

Quindi: K_M = 2[S] - [S] = [S]

La K_M è caratteristica per ogni enzima ed esprime l’affinità dell’enzima per il substrato: più bassa è la K_M e più bassa è la concentrazione di substrato che permette di ottenere la metà della velocità massima, il che indica che enzima e substrato hanno grande tendenza a reagire; viceversa, un alto valore di K_M significa che occorre alta concentrazione di substrato per raggiungere la metà della V_max (E ed S hanno poca tendenza a reagire). I valori di K_M per la maggior parte degli enzimi sono compresi fra 10^-3 e 10^-5 mole/litro.

Vediamo un esempio di quanto appena detto: l’esochinasi e la glucochinasi catalizzano la stessa reazione, cioè la fosforilazione del glucosio (che occorre per intrappolare il glucosio nella cellula). L’esochinasi è attiva nel cervello, la glucochinasi è attiva nel fegato. L’esochinasi ha una K_M pari a 100 microMolare, mentre la glucochinasi ha una K_M pari a 10 milliMolare (attenzione alle unità di misura per capire dopo). Quindi l’esochinasi ha una K_M più bassa rispetto alla glucochinasi. Per questo motivo, l’esochinasi ha una affinità più elevata per il glucosio e cioè le basta una bassa concentrazione di glucosio per far avvenire la reazione di fosforilazione. Questo è fondamentale dato che il glucosio è l’unico metabolita per il cervello.

Fattori che influenzano la cinetica enzimatica

Inibitori

La cinetica delle reazioni enzimatiche viene alterata dalla presenza di sostanze dette inibitori, che possono dar origine a due tipi di inibizione:

• Inibizione competitiva
• Inibizione non competitiva

Nell’inibizione competitiva, l’inibitore, di struttura simile a quella del substrato, va a legarsi nel sito attivo dell’enzima in concorrenza del substrato. Tale fatto diminuisce l’affinità dell’enzima per il substrato: di conseguenza la K_M dell’enzima aumenta in quanto è necessaria una maggiore concentrazione di substrato per ottenere la metà della V_max: quest’ultima invece non viene alterata, poiché se la concentrazione di substrato è molto alta, questo riesce a spostare completamente l’inibitore dal sito attivo e a reagire con la stessa velocità che si avrebbe in assenza di inibitore.

Nel caso dell’inibizione non competitiva l’inibitore si lega all’enzima in una zona diversa dal sito attivo il che induce un’alterazione nella struttura dell’enzima e anche il sito attivo risulta deformato e quindi meno idoneo ad accogliere e a reagire con la molecola di substrato. Il sito attivo potrà ancora ricevere il substrato ma ad una velocità molto rallentata.

Temperatura

Gli enzimi, essendo proteine, sono molto sensibili alla temperatura e un eccessivo aumento (oltre i 60°C) provoca la loro denaturazione con una modificazione, spesso irreversibile, del sito attivo ed una drastica riduzione dell’attività catalitica. In generale un aumento di circa 10°C accelera la velocità delle reazioni enzimatiche di circa il doppio.

pH

Se il pH sale o scende al di fuori del pH ottimale, la velocità della reazione diminuisce per una delle seguenti ragioni:

• C’è una diminuzione della capacità di legame enzima-substrato dovuto alla repulsione delle molecole con stessa carica o a causa di perdita di carica da parte sia dell’enzima che del substrato;
• I gruppi funzionanti da catalizzatori nel sito attivo non sono in uno stato di ionizzazione adeguato;
• L’enzima si denatura.