7Metabolismo e analisi carboidrati (generalita' dei carboidrati, patologie legate all'alterazione del metabolismo dei carboidrati, metodi di analisi del glucosio)

Metodi

Questi metodi sono basati sull'utilizzo di strisce reattive e si distinguono:

Metodi che utilizzano glucometri. I glucometri sono degli strumenti entro i quali viene inserita la striscia reattiva, sulla quale zona reattiva viene posta la goccia di sangue prelevata da un dito dopo essere stato punto. Questi strumenti convertono la variazione di colore che si verifica sulla striscia reattiva in un valore che viene riportato sul display. La conversione di questa variazione cromatica in un valore numerico viene effettuata in due modi diversi: infatti sulla base del principio di funzionamento, si distinguono glucometri fotometrici, che usano una fonte luminosa con filtro e una lente per leggere il cambiamento di colore sulla striscia causata dalla reazione tra il glucosio presente nel sangue e il reagente presente sulla striscia; e glucometri elettrochimici che rilevano una variazione di corrente generata dalla reazione del glucosio con il reattivo presente sulla striscia.

Metodi che...

Utilizzano le strisce colorimetriche: sono strisce reattive impregnate di particolari sostanze, che reagendo con il glucosio determinano un cambiamento di colore. Ogni colore sviluppato rappresenta una specifica concentrazione di glucosio; il colore ottenuto è confrontabile con una tabella di colori di riferimento riportata sull'etichetta del flacone del prodotto e permette di ottenere una valutazione quantitativa della glicemia.

GLUCOMETRO

TEST ORALE DI TOLLERANZA AL GLUCOSIO → Oral Glucose Tolerance Test

Il test orale di tolleranza al glucosio, o OGTT, è un test clinico che viene utilizzato per controllare se un paziente ha un metabolismo del glucosio normale. Viene anche chiamato curva da carico orale di glucosio (o semplicemente curva da carico). Non bisogna limitare l'assunzione di carboidrati nei giorni precedenti al test, l'alimentazione dev'essere il più possibile simile a quella quotidiana. Il paziente deve presentarsi a digiuno da 8-14 ore.

tempi" eseguendo il prelievo basale e poi uno ogni 30 minuti fino alle 2 ore: 0', 30', 60', 90', 120'. In alcuni casi si può fare il prelievo "a sei tempi" prolungando l'esame fino a 180': 0', 30', 60', 90', 120', 180'. (PER IL PROFESSORE IL PRELIEVO SI FA A 0', 30', 60', 90', 120' E 150')

Al test viene generalmente associato quello della insulinemia, cioè la concentrazione di insulina nel sangue, che viene dosata in tutti i prelievi fatti per la glicemia. In questo caso verranno quindi prelevate due provette di sangue ad ogni tempo di prelievo. Si esamina anche l'urina.

L'OGTT permette di valutare come la concentrazione di glucosio (e di insulina nel caso in cui venga associato a dosaggio dell'insulina) cambia nel sangue dopo l'assunzione di una dose nota di glucosio. Quindi permette di capire se il corpo ha un metabolismo glucidico normale o alterato.

In condizioni normali, dopo un carico orale di glucosio, nel sangue aumenta la glicemia dopo qualche minuto. Le cellule beta del pancreas vengono stimolate dall'alta concentrazione di glucosio a secernere insulina, che è già pronta all'interno del loro citoplasma "impacchettata" in vescicole di secrezione. Attraverso il processo dell'esocitosi, le cellule del pancreas riversano l'insulina nel sangue. L'insulina è una piccola molecola con funzione di ormone che stimola i tessuti (soprattutto quello muscolare) a captare e utilizzare il glucosio presente nel sangue, abbassando di conseguenza la glicemia. Nel giro di qualche ora quindi la glicemia scende a livelli simili a quelli basali. Se i valori di glicemia sono alterati significa che il metabolismo del glucosio non è normale, e questo porta a fare diagnosi di diabete. La diagnosi differenziale tra diabete di tipo I e II si può fare associando all'OGTT anche

La valutazione dell'insulinemia. I valori normali di glicemia sono: a digiuno inferiori a 100 mg/dl. I vecchi (1999 secondo l'OMS) parametri di riferimento erano <110 mg/dl, ma dopo recenti studi epidemiologici si è visto che è meglio porre il tetto massimo a un valore minore, appunto <100, perché il rischio di sviluppare diabete e patologie ad esso correlate è risultato inferiore. Dopo due ore dall'ingestione di 75g di glucosio: minori di 140 mg/dl.

I risultati possono essere riportati fra gli assi di un diagramma cartesiano ponendo sull'ascissa i tempi dei prelievi in minuti e sulle ordinate i livelli di glucosio in mg/dl. Si ottiene in tal modo la cosiddetta "curva glicemica". I soggetti non-diabetici non hanno glucosio nell'urina e mostrano il livello glicemico più elevato dopo 30-60 min, e successivamente i livelli di glucosio tornano ad essere bassi e normali. Nei diabetici gravi, invece, la glicemia

sangue è nei limiti normali o aumentata. A tal proposito vengono utilizzate delle cartine, chiamate ketostix, dotate di una zona reattiva in cui sono fissati composti secchi, come il nitroprussiato (un sale di colore rosso), glicina (un aminoacido non polare), e un tampone fortemente alcalino (cioè basico). Il metodo si basa sulla reazione di Legal: l'acido acetacetico e l'acetone (che sono due corpi chetonici) reagiscono col nitroprussiato di sodio ed il fosfato bisodico a pH 9 determinando il viraggio di colore della cartina dopo un intervallo di tempo di circa due minuti. L'entità della colorazione della cartina viene valutata quindi in maniera semiquantitativa: quanto più è intenso il colore rosso-violaceo prodotto tanto più è alta la concentrazione di corpi chetonici nel campione. Più precisamente il colore sviluppato dalla striscia reattiva viene confrontato con una tabella di riferimento in cui vengono riportati i

Vari colori possibili che la cartina reattiva può assumere e le concentrazioni di corpi chetonici relativi a ciascun colore. Nel caso in cui si voglia conoscere la concentrazione precisa dell'acetoacetato o dell'acetone si utilizza il metodo spettrofotometrico: l'acetone reagisce in ambiente fortemente alcalino con la vanillina formando i composti vanillalacetone e divanillalacetone; da tale reazione si genera una colorazione rosso-arancio che presenta il massimo dell'assorbimento a 415nm.

DELL'ACIDO LATTICO - DETERMINAZIONE

Quando la richiesta energetica è impellente (urgente) e/o la disponibilità di ossigeno scarseggia, si verifica un accumulo di NADH derivante dal ciclo di Krebs. Per rigenerare il NAD+ a partire dal NADH e, quindi, permettere la formazione di altra energia viene attuato un processo che effettua questa conversione in modo molto veloce: stiamo parlando della glicolisi anaerobia, durante il quale processo avviene il

trasferimento di uno ione H+ dal NADH al piruvato, che viene pertanto ridotto ad acido lattico. Il quantitativo di acido lattico normalmente prodotto e tollerato da un organismo adulto è di circa 5-18 mg/ml di sangue (equivalenti a 0,005-0,008 mg/dl), ma se l'accumulo superasse questa soglia potrebbe risultare nocivo per la salute. L'acido lattico in eccesso entra nei capillari e si riversa nel torrente circolatorio raggiungendo in breve tempo il fegato, che lo utilizza per ricavarne nuovamente del piruvato e poi glucosio (ciclo di Cori). Oltre all'attività fisica intensa, l'accumulo di acido lattico può essere causato anche da tumori, AIDS, malattie mitocondriali (genetiche), ingestione eccessiva di alcol, anemia, cirrosi epatica, insufficienza renale, crisi respiratoria e, in ultimo, non per importanza, il diabete. Nel diabetico è come se, anche a riposo, il sangue non riesca a ossigenare bene le cellule, per cui si ha la formazione

dell'acidolattico. La misura dell'acido lattico nel sangue richiede particolari precauzioni durante l'effettuazione del prelievo che deve essere eseguito senza stasi (senza laccio); la misura dell'analita deve essere immediata. La tecnica di determinazione della quantità dell'acido lattico nel sangue si basa su un principio enzimatico: l'ossidazione dell'acidolattico a piruvato in presenza di NAD tramite l'enzima lattato deidrogenasi.

Lattato + NAD → Acido piruvico + NADH

Per spostare l'equilibrio a destra in modo da ottenere la ossidazione quantitativa dell'acido lattico, l'acido piruvico viene allontanato mediante aggiunta di idrazina, che in ambiente alcalino, si lega all'acido piruvico consentendo così alla reazione di decorrere fino a termine. Si misura, quindi, attraverso un'analisi spettrofotometrica, l'incremento di assorbanza a 340 nm dovuto alla presenza del NADH. In pratica

Lo spettrofotometro legge l'assorbanza a 340 nm ogni 20 secondi.