6 animali transgenici: generalita' e descrizione di tecniche e strumenti per l'ottenimento di animali transgenici + gene targeting e knock out

Animali transgenici

Lo studio di colture di cellule di invertebrati o di mammiferi permette di indagare su alcune funzioni geniche e di capire determinate patologie. Tuttavia, alcuni tipi cellulari non sono facili da mantenere in coltura, e comunque le colture cellulari stesse come modello non possono far progredire molto uno studio, in quanto non si possono da esse dedurre le possibili interazioni fra i diversi tipi cellulari in un organo o in un intero organismo. Se si deve creare un modello di malattia, abbiamo quindi bisogno di studiare un organismo intero.

Modelli animali

I modelli animali sono molto preziosi nell’aiutarci a capire la funzione di un determinato gene e i processi che portano a una malattia e sono fondamentali anche per studiare l’effetto di farmaci o nuove terapie cliniche prima di passare alla sperimentazione sull’uomo. Sono stati utilizzati come modelli sperimentali varie specie animali.

Nonostante il gran numero dei diversi modelli animali, alcune malattie umane non hanno un modello che le rappresenti in modo adeguato. In teoria, i primati potrebbero essere gli animali modello migliori per le malattie umane. Le grandi scimmie sono state, però, usate raramente a questo scopo, soprattutto per questioni etiche, ma anche per il costo di mantenimento elevato e per altre difficoltà pratiche.

I roditori, invece, sia i ratti che i topi, sono stati ampiamente usati come modelli di malattie per studiare la funzione genica. I roditori, in quanto mammiferi, sono abbastanza simili all’uomo sotto l’aspetto fisiologico, biochimico e genetico, e inoltre hanno dei grossi vantaggi pratici. I topi sono meno costosi da mantenere rispetto ai ratti e sono anche particolarmente adatti per l’analisi genetica. Il corredo cromosomico del topo è molto simile a quello dell’uomo. Possiede 19 coppie di autosomi e due cromosomi sessuali X e Y. La sequenza del genoma del topo è stata pubblicata nel 2002. Anche se la storia evolutiva di uomini e topi si è separata 80 milioni di anni fa, i due genomi hanno moltissimo in comune. Il topo ha praticamente lo stesso numero di geni dell’uomo, circa 25000, ed esiste una perfetta corrispondenza tra uomo e topo per circa l’85% dei geni. Inoltre, c’è un’estesa sintenia tra uomo e topo: con questo termine si indica che ampie porzioni di DNA sui cromosomi di uomo o topo contengono le stesse combinazioni di geni e nello stesso ordine.

Animali transgenici

L’analisi genomica comparativa ha, quindi, confermato quanto atteso già da molto tempo: il topo è un modello sperimentale eccellente per lo studio della funzione dei geni umani e dei meccanismi che correlano alterazioni nei geni a malattie dell’uomo. Alcuni animali modello per lo studio e la descrizione di malattie umane si sono originati spontaneamente. La maggioranza dei modelli animali di malattie, però, è stata prodotta dall’uomo intervenendo a diversi livelli. In alcuni modelli, la malattia è indotta trattando l’animale con agenti chimici o infettivi. In altri, come per alcune malattie autoimmuni, gli animali sono stati ottenuti facendo reagire il loro sistema immunitario in risposta a determinati antigeni: iniezioni dell’adiuvante sintetico “olio di pristano” (un derivato dell’olio di squalo) nel derma dei ratti riesce, per esempio, a produrre un modello di artrite. Altri modelli sono stati ottenuti in seguito a un processo di selezione, che ha consentito di produrre ceppi suscettibili a determinate malattie genetiche. Tuttavia, la maggior parte dei modelli studiati è stata ottenuta mediante manipolazione genetica. Si parla, quindi, di animali transgenici.

Con il termine di animale transgenico si fa riferimento a un animale nato dalla fecondazione di una cellula uovo da parte di uno spermatozoo con formazione di uno zigote nel quale è stato inserito un gene proveniente da un'altra specie (knock in), allo scopo di modificarne le caratteristiche e far loro sviluppare capacità che non avrebbero mai potuto acquisire spontaneamente. Il DNA esogeno che viene inserito è genericamente chiamato transgene, sebbene spesso esso contenga più di un gene. Il transgene è costituito nella stragrande maggioranza dei casi da cDNA.

Gli animali totalmente transgenici sono caratterizzati dalla presenza del transgene in tutte le cellule dell’organismo (sia somatiche che germinali). Se si presentano più linee cellulari e se queste si formano durante le prime divisioni, si parla anche di mosaicismo; se, invece, la presenza di più linee cellulari è dovuta, ad esempio, al fatto che un uovo già fecondato viene nuovamente fecondato da un altro spermatozoo, si parla di chimere. Inoltre, è necessario capire se i cuccioli sono transgenici a livello anche dell’apparato riproduttore (cioè se presentano gameti contenenti il transgene), perché se così fosse, facendoli accoppiare tra loro, si otterrà una linea di topi completamente transgenici. Avere un topo chimerico non è sempre un vantaggio, soprattutto quando si vogliono osservare gli effetti di un gene letale: è chiaro che in presenza di un gene di questo tipo l’organismo muore. Invece, ottenere delle linee di topi transgenici che posseggono in certi tessuti il transgene e in altri no, consente all’organismo di vivere. In certi casi bisogna considerare anche delle porzioni introniche, magari dei siti di giunzione intronici, perché se essi non ci sono, l’espressione del gene può essere anche assente. Più introni inseriamo, più il gene diventa lungo e più la procedura diventa ardua.

Molto spesso durante un particolare momento dell’esperimento, si vuole avere l’attivazione o il silenziamento di un gene. Questo in genere viene fatto tramite l’introduzione nel topo transgenico di farmaci, che però possono causare effetti indesiderati. Sono stati messi a punto dei protocolli che prevedono l’utilizzo di geni, la cui attività può essere indotta con metodi diversi:

• Il gene della metallotioneina e il gene dell’ormone della crescita hanno come induttore Zn e Cd (cadmio);
• Il gene Hop68/lacZ viene indotto mediante shock termico;
• Lac operon promoter è indotto dall’IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside);
• Tet operon promoter è indotto dalla tetraciclina (repressore).

Come si ottengono gli animali transgenici?

La tecnologia per ottenere animali transgenici nacque negli anni '80, quando furono descritti il primo topo transgenico e il primo moscerino della frutta transgenico. Successivamente è stata prodotta una grande varietà di animali transgenici, tra cui vermi, uccelli, rane, pesci e molti mammiferi. In generale, quando si deve inserire un transgene all’interno di uno zigote, ad esempio, bisogna stare attenti che il gene esogeno sia funzionante, cioè che venga espresso: quindi è consigliabile fare una PCR e vedere se il gene funziona, è presente oppure no. In alcuni casi il transgene può essere sovrespresso: se questa situazione non è controllata si hanno seri problemi, perché o non si sviluppa l’embrione oppure nasce un topolino che dopo pochi minuti o ore muore.

Transgenesi mediante la microiniezione

La tecnica più utilizzata per la produzione di animali transgenici è la microiniezione. Prima di descrivere questa tecnica è bene dire che, nel corso della fecondazione, uno spermatozoo si fonde con la cellula uovo: in questo modo nella cellula uovo fecondata vengono a trovarsi due nuclei (chiamati pronuclei), uno derivato dallo spermatozoo e uno dall'uovo. I due pronuclei a un certo punto si fondono e formano il nucleo dell'embrione allo stadio di una cellula (lo zigote).

Per questa tecnica si parte da una femmina che viene sovraovulata, così da avere una produzione di gran lunga maggiore rispetto al normale di cellule uovo (fino a 35 cellule uovo). Questo avviene grazie a un trattamento ormonale: cioè viene iniettato siero di cavalla gravida e a distanza di qualche giorno si aggiunge la gonadotropina corionica umana (che serve a mantenere intatto il corpo luteo fin quando non si forma la placenta per permettere la produzione di progesterone, che durante la gestazione impedisce che avvenga un’ulteriore fecondazione). Dopodiché si fa accoppiare la femmina così ottenuta con un topo maschio e dopo che avviene la fecondazione si prelevano le cellule uovo fecondate prima ancora che avvenga la cariogamia (fusione dei nuclei) in modo che si possano distinguere i due nuclei (quello derivante dalla cellula uovo e quello derivante dallo spermatozoo).

Quindi la microiniezione prevede che una soluzione contenente DNA esogeno venga iniettata nel pronucleo (o maschile o femminile, ma solitamente in quello maschile dal momento che è più grande di quello femminile) attraverso una micropipetta. Questa operazione viene effettuata utilizzando un microscopio ottico a contrasto di fase (bisogna ricordare che non bisogna colorare il preparato, altrimenti muore). Durante questa microiniezione la cellula uovo viene tenuta ferma attraverso l’utilizzo di una pipetta di fissaggio. L’inserimento della micropipetta all’interno della cellula uovo fecondata deve avvenire con un colpo secco. Se così non fosse, e se l’operatore, quindi, procedesse ad inserire molto lentamente la micropipetta nella cellula uovo fecondata, si avrebbe una piccola invaginazione della membrana della cellula uovo stessa. Quando la micropipetta, poi, viene portata a livello del pronucleo maschile per inserire il DNA esogeno, succederebbe che anche l’invaginazione della membrana si inserirebbe all’interno del pronucleo opponendosi all’ingresso del DNA esogeno. Un segnale che deve far capire all’operatore che tutto sta procedendo per il verso giusto è l’ingrandimento del pronucleo maschile durante l’iniezione del DNA esogeno. È molto importante considerare la concentrazione di DNA che deve essere microiniettato nel pronucleo maschile: non bisogna pensare che più sequenze ci metto e maggiore è la possibilità di ottenere un’integrazione positiva del gene. C’è una concentrazione ideale ben precisa: vengono iniettati 1 o 2 pl (picolitri) di una soluzione contenente DNA lineare alla concentrazione di 1 o 2 μg/ml. In questo modo è previsto che si integrino circa 200-400 molecole che hanno una lunghezza di circa 5kb.

Queste copie di DNA che vengono iniettate sono solubilizzate all’interno di un tampone, il quale deve essere ben calibrato: deve contenere tris 5-10 mM e avere un pH=7,4; deve contenere EDTA 0.1-0.25 mM (si è visto che con 1 mM di EDTA la cellula uovo utilizzata riduce la sopravvivenza del 10%; se vengono utilizzati 5mM di EDTA, la cellula muore; mentre, se l’EDTA viene rimosso completamente si riduce la sopravvivenza degli embrioni e viene ridotta anche l’efficienza di integrazione del DNA). Il DNA che viene iniettato deve essere puro: non ci deve essere la presenza di eventuali contaminanti. Inoltre, il DNA deve essere sciolto molto bene nel campione: non si devono formare aggregati all’interno della soluzione; un DNA ben disciolto riesce a passare facilmente attraverso l’ago della micropipetta e raggiunge, quindi, facilmente il pronucleo maschile; se non fosse disciolto bene, l’ago della micropipetta verrebbe intasato con il rischio di rompere le uova.

Per evitare la presenza di aggregati nella soluzione contenente DNA, tutti i componenti che vanno a costituire la soluzione vengono prima filtrati con dei filtri costituiti da pori con diametro di 0,2 μm. La purificazione del DNA solitamente viene effettuata utilizzando un gel costituito da un agarosio con un basso punto di fusione (agarose low-melting). In genere si procede effettuando una corsa elettroforetica e successiva osservazione al transilluminatore. Viene, quindi, ritagliata la porzione di gel in cui si osserva la banda colorata e si inserisce questo pezzetto di gel in una eppendorf. Si aggiungono, poi, 3 volumi di buffer QG ad 1 volume di gel (ad esempio 300 microlitri di buffer e 100 mg di gel). Il Buffer QG (o Qiagen Buffer) è composto da tiocianato di guanina e Tris HCl, che permettono di sciogliere l’agarosio permettendo così la liberazione del DNA dalle maglie del gel stesso. Lo scioglimento dell’agarosio è favorito anche da una incubazione per 10 minuti a 50°C. Una volta fatto questo si trasferisce il tutto in una colonnina da centrifuga, cioè una piccola provetta in cui è presenta una sorta di membrana. Questa colonnina viene centrifugata per 1 minuto a massima velocità. In questa fase il DNA si lega alla membrana, il resto attraversa la membrana. Si aggiunge poi il buffer EB che stacca il DNA dalla membrana dopo una nuova centrifugazione. Il campione di DNA così purificato è, quindi, pronto per essere iniettato.

Dopo essere stato microiniettato nel pronucleo, il DNA si integra in modo casuale in un cromosoma, di solito in un unico sito. Il DNA introdotto si integra nel DNA dell’ospite a livello di un nick (rottura a singolo filamento) che si trova casualmente nei cromosomi. Bisogna stare attenti a non far avvenire l’integrazione del gene esogeno in regioni diverse da quelle che ci interessano, altrimenti la fisiologia dell’organismo verrà alterata. L’integrazione del DNA nel cromosoma risulta stabile nel 10-40% dei topi: significa che negli altri casi l’integrazione avviene, però poi si destabilizza in qualche modo. L’integrazione può avvenire con più sequenze: in questo caso le sequenze si inseriscono una di seguito all’altra con un andamento testa-coda. Avvenuta l’integrazione del DNA esogeno, si fa sviluppare la cellula uovo fecondata fino allo stadio di blastocisti. Questa poi viene reimpiantata nell’ovidotto di femmine pseudo-gravide (femmine accoppiate con un maschio vasectomizzato, cioè sterile, affinché subiscano i cambiamenti ormonali che permettano l’impianto e lo sviluppo dell’embrione). Per vasectomizzazione si intende l’operazione secondo la quale nel maschio vengono tagliati i dotti deferenti in modo da non far avvenire l’eiaculazione. Dopo tre settimane, dalle blastocisti impiantate nell’ovidotto di femmine pseudo-gravide nascono i topolini, di cui non tutti sono transgenici.

Se il transgene si integra immediatamente, quando lo zigote è ancora allo stadio di un’unica cellula, il topo risultante sarà totalmente transgenico, ovvero tutte le cellule del suo organismo (sia quelle somatiche che quelle germinali) conterranno il transgene. La situazione che si presenta più frequentemente, però, è quella in cui il DNA si integra dopo una o due divisioni cellulari, e quindi l’animale che si svilupperà sarà un mosaico, formato sia da cellule transgeniche sia da cellule non trasformate. Quando le cellule transgeniche andranno a formare la linea germinale (cioè i gameti), il transgene passerà alla generazione successiva dando origine ad animali totalmente transgenici. Il rendimento di questa tecnica è basso: infatti, su 1000 uova trattate con la microiniezione del pronucleo maschile, si ottengono 30-50 topi transgenici.

L’immagine riportata di seguito mostra l’efficienza complessiva di transgenesi (ottenuta mediante microiniezione) in seguito a microiniezione di DNA, avendo come modello bovini, suini, ovini e topi. Vediamo che 100 saranno le uova all’interno delle quali viene iniettato il DNA esogeno; quelle impiantate saranno circa 80% per quanto riguarda gli ovini, mentre per i bovini l’impianto è molto più basso (circa il 10%). I nati vivi sono ancor di meno (quelli che sopravvivono maggiormente sono gli ovini, circa 20%). La prole transgenica è quasi pari a zero e notiamo una netta differenza tra topi e le restanti specie: i topi rappresentano la specie che si presta nel miglior modo a questi esperimenti.

Cos’è un micromanipolatore

La tecnica sopra descritta viene eseguita attraverso un micromanipolatore. Un micromanipolatore è un dispositivo che viene utilizzato per interagire fisicamente con un campione al microscopio, dove è necessario raggiungere un tale livello di precisione dei movimenti che non può essere realizzato a mano libera. Solitamente questo dispositivo è associato a un microscopio ottico a contrasto di fase. Immaginiamo, appunto, il microscopio disposto al centro, e a destra e a sinistra di questo strumento ci sono due joystick (due manopole; una per ogni lato). Una manopola è collegata e permette il movimento della pipetta di fissaggio, che mantiene ferma la cellula uovo; l’altra manopola, invece, è connessa e permette il movimento della micropipetta che viene utilizzata per iniettare il transgene nel pronucleo maschile. La punta della micropipetta ha delle dimensioni talmente piccole che se paragonate alla cruna di un ago, questa risulta molto più grande. Di conseguenza, l’ago della micropipetta rompe tranquillamente la zona pellucida dell’uovo fecondato, attraversa la membrana della cellula uovo fecondata e si infila nel pronucleo maschile senza creare danni né agli involucri della cellula uovo fecondata e tantomeno alla membrana del pronucleo. La pipetta di fissaggio è connessa a un sistema che permette di esercitare una pressione negativa (una sorta di risucchio) che permette di fissare la cellula uovo, dato che non può essere tenuta ferma con un gancio dal momento che questo romperebbe la membrana della cellula stessa, creando danni irreversibili.

La pipetta di fissaggio (o pipetta hatching) è dotata di una piccola asticella (come fosse un manico) che termina con una piccola porzione che con l’asticella forma un angolo di 15°. Questo è dovuto al fatto che le cellule che vengono manipolate sono