5 b Mutagenesi mirata (batteriofago m13, metodo di Kunkel, DNA plasmidico, overlap extension pcr, megaprimer method, ) + mutagenesi casuale

OVERLAP EXTENSION PCR

La overlap extension polymerase chain reaction (OE-PCR) è una variante della PCR che è usata per inserire mutazioni in specifici punti di una sequenza o per unire frammenti di DNA più piccoli in un polinucleotide più grande.

Per inserire una mutazione in una sequenza di DNA tramite questa tecnica bisogna innanzitutto preparare due miscele di reazione per PCR, ciascuna contenente la stessa molecola di DNA nella quale si vuole introdurre una mutazione. Questa molecola di DNA può essere un gene clonato in un vettore. Vengono progettate, inoltre, due coppie di primer da inserire in ciascuna miscela: in una miscela si inserisce un primer che lega per complementarietà la regione 3' del filamento antisenso e un primer che si associa per complementarietà (tranne che per un nucleotide, in quanto modificato) alla regione dell'altro filamento, dove si vuole inserire la mutazione; mentre, nell'altra miscela, i primer

Sono progettati in modo che uno lega l'estremità 3' del filamento senso e l'altro primer (modificato) si associa a una regione dell'altro filamento complementare alla regione alla quale si è associato il primer modificato nell'altra miscela (vedi primer 1 e 2 nel disegno). Il primer modificato che si associa a una regione interna di un filamento di DNA in una miscela è complementare al primer modificato che si associa a una regione interna di un filamento della stessa molecola di DNA inserita nell'altra miscela. Nel disegno i primer 2 e 3 (che portano un nucleotide mutato) sono tra loro complementari e, quindi, portano anche la stessa mutazione. Inoltre nel disegno la x indica il punto in cui si vuole inserire la mutazione. Quindi, facendo un ciclo di PCR, i primer che si sono associati all'estremità 3' vengono normalmente allungati copiando il filamento parentale, ottenendo una molecola identica a quella di partenza.

Anche i primer che si sono appaiati con una stessa regione interna nelle due molecole di DNA uguali e poste in provette diverse vengono allungati, ma in questo caso verrà copiata solo una piccola porzione del filamento parentale: in una provetta si formerà una molecola identica alla porzione sinistra della molecola iniziale e nell'altra provetta si formerà una molecola identica alla porzione destra della molecola iniziale. Queste molecole frammentate portano un filamento mutato (asterisco) in una specifica regione (e cioè il primer) e un filamento non mutato. Quindi, schematicamente, si ottengono le seguenti molecole.

Primer 4

Primer 2* 5'3'

5' 3'.5' 3'

Primer 1 Primer 3*

Questi prodotti vengono a loro volta amplificati. Considerando solo le molecole che rappresentano una porzione del DNA iniziale avremo:

* 5'3' *3' 5'3'5' 5' 3'*

* 5'3'

5'3'3'5' 5' 3' Si formano, quindi, molecole che portano su entrambi i filamenti la mutazione e molecole che portano entrambi i filamenti wild type. All'interno di ogni miscela di reazione, al termine della PCR, si ottengono molecole identiche a quella iniziale e molecole che rappresentano solo la porzione sinistra o solo la porzione destra della molecola iniziale. Queste molecole frammentate, inoltre, sono caratterizzate alcune da entrambi i filamenti mutati, altre da entrambi i filamenti wild type. Per questo motivo le miscele vengono inserite in gel d'agarosio e sottoposte a una corsa elettroforetica, seguita da Southern Blot per isolare e purificare solo le molecole di DNA che rappresentano la porzione destra e sinistra della molecola iniziale e che portano la mutazione su entrambi i filamenti. Si procede, poi, con un processo di rinaturazione. Consideriamo le due molecole con entrambi i filamenti mutati in una posizione. Per sintetizzare queste

molecole sono usati come filamenti stampo quei filamenti che nel primo ciclo di PCR sono stati ricavati a partire da primer mutati (i quali primer sono traloro complementari). Quindi i filamenti di nuova sintesi avranno all'estremità 3' una sequenza complementare al primer mutato. L'estremità 3' mutata di un filamento va ad accoppiarsi, in seguito a denaturazione, all'estremità 3' mutata del filamento che apparteneva a un'altra molecola. Queste estremità sono tra loro complementari dal momento che sono complementari ai primer mutati utilizzati inizialmente.

*5' 3' 5'3' *

In seguito a questo accoppiamento tra estremità 3' di due frammenti diversi interviene la polimerasi che ricolma i vuoti e si ottiene una molecola intera e identica a quella iniziale ma con una mutazione nel punto desiderato. Ovviamente si ottengono anche molecole non mutate identiche a quella iniziale e molecole non mutate.

frammentate e, pertanto, si devono riconoscere e isolare le molecole mutate attraverso, ad esempio, la tecnica del Southern Blotting. MUTAGENESI MIRATA TRAMITE PCR: MEGAPRIMER METHOD Per questo metodo vengono usati 3 primer: un primer A che è un forward; il primer B che è un reverse; e il primer M che ha la mutazione (indicata con l'asterisco) che si desidera inserire. In una prima PCR, nella miscela di reazione si aggiunge la molecola di DNA nella quale si vuole inserire la mutazione, la polimerasi, il primer A e il primer M (se questo è stato progettato per essere reverse; altrimenti, se il primer M è progettato per essere un forward si utilizza il primer B). Quindi, in un primo ciclo di PCR avviene la denaturazione della molecola di DNA iniziale. Supponiamo che vengano utilizzati i primer A e M. Quindi il primer A legherà l'estremità 3' del filamento antisenso e il primer M legherà una regione interna dell'altro.

filamento.5’ 3’

Molecola di DNA damodificare5’3’

Denaturazione5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

5’ 3’

Primer M * Primer A

Polimerasi

Primer A

Primer M *

Il primer mutato contiene un sito di restrizine all’estremità 5’ in modo da eliminare la porzione di filamento stampo che va dall’estremità 5’ del primer all’estremità 3’.

Attraverso una corsa elettroforetica si purificano le molecole che contengono la mutazione. Queste vengono aggiunte a una miscela di PCR insieme alla molecola nella quale si vuole inerire la mutazione. In seguito al processo di denaturazione, oltre ad essere denaturata la molecola di DNA di partenza, vengono denaturate anche le varie molecole con la mutazione. Questi filamenti singoli contenenti la mutazione, essendo dei frammenti della molecola di DNA iniziale, vengono utilizzati come dei primer. Avendo dimensioni più grandi prendono il nome di megaprimer.

quindi in questomodo, attraverso i vari cicli di PCR si ottengono le mutazioni su entrambi i filamenti della molecola. Megaprimer MUTAGENESI CASUALE Le tecniche di mutagenesi sito diretta presuppongono non solo la conoscenza della sequenza che si intende modificare, ma anche una certa conoscenza delle proprietà della proteina prodotta dal gene in esame. Se invece non si conoscono struttura e funzione della proteina, è possibile modificare la sequenza del gene attraverso mutagenesi casuale. MUTAGENESI CASUALE CON OLIGONUCLEOTIDI DEGENERATI E PCR Questa tecnica è identica alla overlap extension PCR. In quest'ultima, però, si usano oligonucleotidi primer con una singola mutazione in uno specifico punto e il primer è progettato in modo da appaiarsi a una specifica posizione del DNA bersaglio (che può essere una sequenza di DNA che verrà inserita in un vettore o un gene già presente nel vettore). Quindi, significa che la sequenzaall'interno della quale si vuole inserire una mutazione è una sequenza conosciuta e il primer è progettato in modo specifico. Nel caso della mutagenesi casuale mediante oligonucleotidi degenerati e PCR, bisogna innanzitutto dire che la sequenza della molecola di DNA da modificare non è conosciuta. Gli oligonucleotidi possono essere progettati sulla base di sequenze omologhe a quella in cui vogliamo inserire una mutazione, che sarà di conseguenza casuale. Per oligonucleotidi degenerati si intendono primer che in alcune posizioni possono presentare casualmente una delle quattro basi. Gli oligonucleotidi degenerati vengono sintetizzati da opportune macchine in cui ci sono 4 provette da cui vengono pescati gli (A, T, C, G)TP in giuste concentrazioni. Se nella boccettina delle G, ad esempio, vengono inseriti tutti e 4 i nucleotidi in concentrazioni diverse, la macchina non lo sa, e, durante la sintesi degli oligonucleotidi, va a pescare in modo casuale uno dei quattro nucleotidi.

casualeall'interno di quella provetta. Per cui, in questo modo vengono sintetizzati primeruguali tra loro, ma che in determinate posizioni prefissate dall'operatore possonopresentare una qualsiasi base.

Quindi questi oligonucleotidi vengono utilizzati come primer durante una PCR. Quindi,per inserire una mutazione casuale, nella miscela di reazione si aggiungono lecomponenti necessarie a far avvenire la replicazione, quali DNA polimerasi,deossinucleotidi trifosfati, la molecola di DNA a doppio filamento di interesse e glioligonucleotidi degenerati. Ciascun oligonucleotide si appaia casualmente a unaregione interna di un filamento della molecola di DNA iniziale. L'appaiamento dei dueprimer avviene su due regioni tra loro complementari di due filamenti distinti di unastessa molecola. In seguito all'annealing, la DNA polimerasi allunga ciascun primer indirezioni opposte. Si vengono, cioè, a formare due molecole a doppia elica: unacorrisponde a una metà

della molecola inziale; l'altra corrisponde all'altra metà dellastessa molecola iniziale. 3'5'3' 5'3' 5'5' 3' 5'3' 3'5'Inoltre, dato che i primer si sono appaiati a due regioni tra loro complementari di duefilamenti distinti, un'estremità di una molecola si sovrappone all'estremità dell'altra.Cioè le estremità 3' di ciascun filamento parentale delle nuove molecole sono tra lorocomplementari. Ad un nuovo ciclo di replicazione, ciascuna delle molecole neoformateverrà denaturata e ogni singolo filamento funge da stampo. Si formano, quindi,molecole che presentano su entrambi i filamenti l'oligonucleotide degenerato emolecole che mancano su entrambi i filamenti dell'oligonucleotide degenerato.Terminata la PCR si purificano le molecole frammentate che portano le mutazio