5 b Mutagenesi mirata (batteriofago m13, metodo di Kunkel, DNA plasmidico, overlap extension pcr, megaprimer method, ) + mutagenesi casuale

Mutagenesi sito specifica

La mutagenesi sito specifica è una tecnica di biologia molecolare in cui una mutazione è creata in modo selettivo in un particolare sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide. In genere la mutagenesi sito specifica richiede la conoscenza della sequenza di tipo selvatico del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita potrà essere una sostituzione di base o una inserzione o delezione di nucleotidi rispetto alla sequenza originaria.

La mutagenesi mirata potrebbe essere utile a modificare le proprietà di una proteina, processo che risulta essere molto arduo. Per questo, più che modificare una proteina, si preferisce modificare la sequenza genica che codifica per quella determinata proteina. La mutagenesi mirata contro le proteine potrebbe essere vantaggiosa per ottenere, ad esempio, delle particolari proteine eterologhe. Le proteine eterologhe, oltre che essere proteine farmacologicamente attive, possono essere utilizzate anche in campo industriale.

Applicazioni industriali

Ad esempio, nei detersivi viene aggiunto un enzima chiamato subtilisina, che è attivo quando è presente il calcio. Nel processo della produzione dei detersivi, c’è una fase in cui viene utilizzato l’EDTA (è un chelante di vari ioni metallici). Se nel processo esso è presente nel mezzo in cui viene effettuata la produzione dei detersivi, la subtilisina non può agire perché non sarà più presente il calcio. Per risolvere questo problema, si potrebbe creare una subtilisina che sia attiva anche in assenza di calcio: bisognerebbe, quindi, modificare la conformazione proteica.

Per farlo si potrebbe agire, come detto, sulla sequenza del gene codificante e clonato in un vettore. In questo modo si possono ottenere proteine le cui proprietà sono più adatte alle applicazioni industriali e terapeutiche più di quanto non lo siano le proteine omologhe naturali. Si potrebbe, per esempio, aumentare la resistenza degli enzimi alle proteasi; modificare il sito di legame del substrato di un enzima per aumentare la specificità; modificare un enzima in modo tale che non sia più necessario il cofattore ecc.

Metodi sperimentali

Ci sono diversi metodi sperimentali per realizzare la mutagenesi mirata dei geni clonati:

Mutagenesi mirata basata sul batteriofago M13

Il Fago M13 è un fago filamentoso ed è costituito da DNA a singolo filamento. M13 infetta solo ceppi batterici F+ poiché entra nella cellula batterica attraverso il pilo codificato dal fattore F. Il filamento di DNA che penetra nella cellula è a singolo filamento ed è chiamato "+ strand".

Una volta entrato nella cellula, il DNA viene convertito in una molecola circolare a doppio filamento chiamata "Replicative form" (RF). Il DNA ds viene più volte replicato e contemporaneamente vengono trascritti i geni che codificano per le proteine strutturali del fago. Quando sono state sintetizzate circa 100-200 copie della forma replicativa, inizia una replicazione a cerchio rotante di queste molecole a doppio filamento: viene creato un nick sul filamento + e viene allungata l’estremità 3’-OH.

Man mano che viene sintetizzato il nuovo filamento +, quello vecchio viene linearizzato. Quando tutto il nuovo filamento + è sintetizzato, quello vecchio sarà totalmente estruso dalla molecola e circolarizzerà a formare, quindi, una molecola a singolo filamento circolare che viene agganciata da proteine (proteina Gp5) che evitano una sua successiva replicazione. Questo tipo di replicazione delle forme a doppio filamento continua fino a formare circa 1000 copie a singolo filamento (+). I filamenti possono così essere impacchettati nel capside e il fago viene estruso dalla cellula senza lisarla.

Utilizzo del genoma del fago M13

Il genoma del fago M13, nella sua forma replicativa intermedia, viene utilizzato come vettore di clonaggio. Un particolare vettore di clonaggio che sfrutta il ciclo vitale del fago M13 è chiamato "Phagemid". Il Phagemid è una molecola circolare di DNA a doppio filamento che contiene un'origine di replicazione plasmidica (Ori V) e l'origine di replicazione di M13 ma non contiene i geni che codificano per le proteine strutturali del fago.

Nel vettore fagico M13 è presente anche un gene lac Z (per la selezione bianco/blu), all’interno del quale gene è inserita una regione poli linker che contiene diversi siti di restrizione per il clonaggio del gene di interesse. Poiché il phagemid contiene solo l'origine di replicazione fagica e plasmidica, il gene lac Z per la selezione, i siti di restrizione e i geni per la replicazione, ma non contiene i geni per la produzione del capside, l’infezione di una cellula da parte di questo vettore sarà accompagnata dall’infezione da parte dell'Helper Phage M13K07.

Tale fago contiene una origine di replicazione e codifica per tutte le proteine strutturali del fago. Per clonare un gene nel vettore fagico M13, si linearizza il vettore M13 a doppio filamento (forma replicativa) mediante enzimi di restrizione che agiscono a livello della regione poli linker localizzata nel gene lac Z. Si mescola il vettore linearizzato con l’inserto avente estremità coesive compatibili con quelle del vettore. Si aggiunge la ligasi che salda l’inserto nel sito di clonaggio del vettore.

Il vettore, così clonato, viene inserito tramite trasformazione in cellule di E.coli. Nell’ospite batterico il vettore verrà replicato prima in maniera bidirezionale producendo copie a doppia elica e poi a cerchio rotante producendo copie a singola elica. Si selezionano le placche di colore bianco dopo aver aggiunto al terreno il substrato x-gal. Quelle che appaiano di colore bianco sono le colonie batteriche che contengono il vettore clonato, il quale gene lac Z è stato silenziato dall’integrazione dell’inserto; le colonie blu vengono scartate perché contengono il vettore privo dell’inserto evidenziato dal fatto che il loro gene lac Z è funzionante e il suo enzima causa l’idrolisi dell’x-galattosio con formazione di una colorazione blu.

Per introdurre una mutazione in uno specifico sito di un gene clonato nel vettore fagico M13, bisogna trasfettare il vettore M13 a singolo filamento ricombinante, formato col metodo prima descritto, in un particolare ceppo di E. coli (chiamato dam+; cioè batteri dotati del gene dam). Il gene dam codifica per l’enzima metilasi che trasferisce un gruppo metilico all’N6 dei residui di adenina nella sequenza GATC, così che il DNA M13 ricombinante risulterà metilato.

Questo ssDNA verrà trasformato nella replicative form e replicato prima bidirezionalmente e poi attraverso il cerchio rotante a formare molecole di DNA metilate a singolo filamento. Queste molecole vengono impacchettate nei nucleocapsidi e liberate verso l’esterno. Vengono quindi purificate le molecole a singolo filamento e mescolate in vitro con oligonucleotidi primer complementari al gene in cui vogliamo inserire la mutazione.

Per inserire la mutazione bisogna disegnare un oligonucleotide primer contenente una base mutata e che, quindi, non si appaia per complementarietà con la corrispondente base sul gene. La presenza di questa base mutata determina la conversione di un codone in un altro. Il primer, inoltre, deve essere progettato in modo da appaiarsi al DNA nel vettore anche se non perfettamente complementare.

Una volta appaiatosi, il primer mutato viene esteso usando una polimerasi per la creazione del nuovo filamento. La polimerasi che viene usata in questo caso è il cosiddetto frammento di Klenow. In pratica la polimerasi batterica (DNA polimerasi I) viene trattata con una proteasi (subtilisina), che scinde l’enzima DNA polimerasi in due frammenti, di cui il maggiore è proprio il frammento di Klenow che possiede attività polimerasica 5’→3’ e attività esonucleasica 3’→5’ (per la rimozione dei nucleotidi già incorporati e per analisi di ma non possiede attività esonucleasica 5’→3’.

Il vettore fagico M13 è costituito ora da due filamenti: uno presenta la sequenza wild type del gene; l’altro presenta la sequenza mutata in una specifica posizione. In presenza dell’Helper Phage il vettore M13 ds può replicarsi e si formano tante molecole identiche di vettore fagico ricombinante a doppio filamento. Utilizzando delle sonde in grado di legarsi all’oligonucleotide modificato, si isolano le forme a doppia elica del vettore contenente il gene mutato.

Questi vettori a doppia elica contenenti il gene mutato vengono digeriti con l’enzima di restrizione DpnI metilsensibile, cioè taglia solo il filamento metilato. Questo verrà poi digerito con le nucleasi e rimane intatto il filamento con la sequenza mutata del gene. Si estrae da questi vettori, per mezzo di enzimi di restrizione, il gene mutato e lo si inserisce in un vettore di espressione plasmidico.