4a Ingegneria tissutale: pelle ingegnerizzata_ generalita' della pelle e tecniche per la creazione della pelle ingegnerizzata

Trapianto di sostituti cutanei

Innanzitutto va precisato che alcune lesioni cutanee danneggiano esclusivamente l'epidermide, mentre altre, essendo più profonde, danneggiano anche il derma. Nel primo caso, quindi, si potranno trapiantare dei sostituti epidermici, nel secondo ci sarà bisogno di sostituti dermici (in alcuni casi dopo il trapianto dei sostituti dermici ci sarà bisogno anche di un trapianto di sostituti epidermici).

Innanzitutto va precisato che i sostituti cutanei in generale possono essere classificati in sostituti dotati di componente cellulare e sostituti acellulari. Possono essere anche classificati in sostituti sintetici e sostituti biologici (costituiti da materiale biodegradabile).

Per creare i sostituti dell'epidermide bisogna innanzitutto prelevare un lembo di epidermide tramite biopsia cutanea di un'area possibilmente sana e nascosta, come la regione retroauricolare o la regione inguinale. Il frammento di cute che viene inviato in laboratorio deve...

essere a tutto spessore, cioè di dimensioni pari a 2cmx1cm. Entro due giorni dal prelievo, la biopsia viene trattata in un laboratorio sterile, attuando dapprima la separazione meccanica di epidermide e derma, e successivo isolamento delle cellule dell'epidermide mediante digestione enzimatica. Di queste cellule epidermiche, vengono seminate sullo scaffold solo le cellule staminali oloclone. Queste cellule sono localizzate a livello dello strato basale dell'epidermide, ma anche a livello del derma e più precisamente nei follicoli piliferi. Si è visto che estraendole dal derma e ponendole in coltura, si possono differenziare in neuroni e cellule della glia, derivati del mesoderma (adipociti, osteociti, condrociti e cellule muscolari), cellule ematopoietiche ecc. Le cellule staminali epidermiche si trovano al vertice delle papille dermiche: nel momento in cui queste si dividono, arrivano a livello della cresta epidermica e poi risalgono verso

L'esterno.Transit Amplyfic Cells, cioè cellule staminali che hanno avviato un programma di differenziamento per formare i cheratociti e quindi perdono via via la potenzialità. Sono proprio le cellule localizzate all'apice delle papille dermiche che vengono utilizzate per la costruzione dei sostituti dell'epidermide. Per distinguere queste cellule dalle altre si fa affidamento ai marcatori (proteine) che vengono espressi specificamente da queste stesse cellule. Tra questi marcatori si annoverano le β-1-integrine e la proteina p63 (che è il principale regolatore dell'espressione genica nelle cellule dell'epidermide). Le integrine sono delle glicoproteine di membrana che si associano agli elementi della matrice extracellulare. Le integrine sono eterodimeri obbligati contenenti due distinte catene, chiamate subunità α (alpha) e β (beta). Sono state individuate circa 18 subunità α ed 8 β. (vedi capitolo "Colture cellulari").

Quindi, le cellule staminali estratte dal lembo di pelle vengono seminate su uno scaffold insieme ai fibroblasti e a cellule endoteliali. Queste ultime sono utili per far si che avvengano i processi di angiogenesi, cioè formazione di vasi sanguigni (in questo caso, capillari). Questo costrutto (sostituto epidermico), tuttavia, presenta un importante limite: esso potrebbe non aderire al derma sottostante nel caso in cui questo sia poco vascolarizzato o vi sia in corso un'infezione. Per questo motivo spesso si utilizza un substrato dermico privato della componente epidermica come supporto su cui vengono seminati e fatti crescere i cheratinociti prelevati da un lembo di pelle del paziente in modo da creare una componente epiteliale. Si parla, in questo caso, di SOSTITUTI DERMO-EPIDERMICI. Esempi di substrati dermici su ciascuno dei quali è presente una componente epidermica ottenuta mediante semina e successiva proliferazione di cheratinociti sono i prodotti LASERSKIN e HYDRODERM.Il primo è un sostituto epidermico naturale; il secondo è sintetico. Laserskin, ad esempio, è costituito da una membrana sottile e trasparente di acido ialuronico sulla quale si estende uno strato epidermico di cheratinociti autologhi: cioè, viene prelevato un lembo di pelle; questo viene mandato in laboratorio dove derma ed epidermide vengono divisi e prelevati i soli cheratinociti dell'epidermide; questi vengono posti in coltura dove proliferano e da qui vengono seminati sullo scaffold dermico di acido ialuronico e dopo circa 3 settimane dal prelievo della biopsia il prodotto viene rispedito negli ospedali, in confezione sterile, per essere impiantato sul letto della ferita. Hydroderm è un prodotto costituito da uno scaffold dermico sintetico di poliuretano sul quale, come in Laserskin, viene creato uno strato epidermico a partire da cheratinociti isolati da un lembo di pelle prelevato dal paziente stesso. In alternativa all'utilizzo di cellule

autologhe si possono creare, con la medesima procedura, alloinnesticaratterizzati da un costo più ridotto compensato, tuttavia, da un possibile rischio dicontaminazione. Ad esempio, la membrana amniotica funge, analogamenteall’epidermide, da barriera grazie alla presenza di collagene e fibronectina. LaMembrana Amniotica e costituita da un singolo strato di cellule epiteliali, poggianti suuna membrana basale. Il prodotto EPIFIX è un esempio di membrana amnioticadisidratata disponibile in commercio. La membrana amniotica promuove laproliferazione e la differenziazione di diverse tipologie cellulari, rilasciando importatifattori di crescita. E’ stata osservata la presenza di diversi fattori di crescita tra cui ilfattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita trasformante (TGF-α, TGFβ1,TGF-β2, TGF-β3), il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) e il relativo recettore(KGFR), il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e il

relativo recettore (HGFR) e deifibroblasti (FGF) localizzati nell’epitelio della membrana amniotica. I fattori di crescitasvolgono un ruolo critico nella regolazione dello sviluppo dei tessuti, in particolar modoil TGF-β aumenta la sintesi degli inibitori della proteasi, promuove l’adesione cellularee sopprimere la sintesi della proteasi degradante la matrice, stimolando la sintesi e ladeposizione delle proteine della matrice extracellulare. Per ottenere la membranaamniotica viene innanzitutto prelevata la placenta in sala operatoria. Una voltaarrivata presso i laboratori, viene lavata con fisiologica sterile, per liberarla dal sanguee dai coaguli ematici, si scolla la membrana amniotica dal corion sottostante, facendoattenzione a non danneggiarla. Una volta isolata, presenta un aspetto trasparente, nonvascolarizzata e con una buona resistenza alla trazione.Dopo ripetuti lavaggi, la membrana viene distesa sopra un filtro di nitrocellulosa. Lamembrana viene immersa in

Un cocktail antibiotico a +4°C per 24 ore in condizioni sterili. La membrana viene ritagliata in patch di varie dimensioni a seconda dei vari utilizzi: dalla 3x3 cm² in campo oculistico, alla 10x15 cm² per i grandi ustionati. I patches vengono, poi, immersi in vapori di azoto liquido a -180°C. Quando il chirurgo richiede il patch di membrana, esso viene scongelato in un bagnetto termostatato a +60°C, il filtro di nitrocellulosa viene cambiato e il tessuto ripetutamente lavato con soluzione fisiologica sterile per eliminare la sostanza crioconservante. Un tessuto conservato in azoto liquido dà una risposta immunologica minore perché viene conservato a -140°C e poi successivamente scongelato, ciò fa sì che i recettori di istocompatibilità vengano notevolmente ridotti. Il tessuto una volta scongelato può essere conservato a +4°C per un massimo di 7 giorni. La conservazione della membrana amniotica potrebbe ridurre la sua proprietà angiogenica.

in quanto le cellule trattate non sono vitali e non permettono la vascolarizzazione. Per questo motivo, è stata introdotta la crioconservazione in vapori di azoto liquido con crioprotettori che permettono di mantenere una corretta integrità cellulare della membrana. Come detto, le ferite poco profonde richiedono il solo processo di riepitelizzazione che può essere favorito dall'utilizzo di epiteli creati in vitro che poggiano su uno scaffold di derma per favorire l'attecchimento. Dato che lo scopo della presenza di uno scaffold dermico è solo quello di favorire l'attecchimento dello strato di cheratinociti, lo scaffold dermico può essere molto sottile e quindi comprendere solo la parte superficiale del derma. Per il trattamento di lesioni cutanee profonde, invece, devono essere sostituiti sia l'epidermide che il derma. La perdita di estese regioni di derma potenzia la formazione di cicatrici. Il derma presenta un rilevante vantaggio che

lorende un buon candidato per realizzare un tessuto ingegnerizzato con scopo terapeutico. I fibroblasti, infatti, costituenti principali del derma, crescono bene in coltura e hanno un'elevata capacità proliferativa. Inoltre l'impianto di fibroblasti allogenici non stimola alcuna risposta immunitaria. Per rimarginare, quindi, ferite profonde c'è bisogno di costruire dei SOSTITUTI DERMICI. Lo scaffold può essere costituito da biomateriali naturali o sintetici e può anche essere privo di cellule. Materiali biologici naturali, come la pelle umana o porcina, possono essere impiegati come sostituti perché provvedono a mantenere strutturalmente intatta la matrice extracellulare di elastina e collagene. Tuttavia resti di cellule del donatore portano a rigetto dopo circa 10-15 giorni dall'applicazione. Pertanto questi costrutti vengono usati come rivestimenti temporanei piuttosto che come sostituti permanenti. D'altra parte l'uso di

tessuti umani o di animale ha come requisito la sterilizzazione per prevenire la trasmissione di malattie. Metodi di sterilizzazione aggressivi quali il trattamento con ossido di etilene o radiazioni gamma inducono modifiche strutturali non sempre accettabili nel derma; minor effetto sulla struttura ha invece il trattamento con glicerolo. Nel corso degli anni sono stati creati dei sostituti dermici mancanti di una componente cellulare che sarebbe in grado di sviluppare una risposta immunitaria da parte dell'ospite e, quindi, rigetto. Un esempio di sostituto dermico acellulare presente in commercio è ALLODERM. Esso si ottiene trattando chimicamente la pelle fresca prelevata da cadavere con lo scopo di privarla dell'epidermide e distruggere le cellule ancora in vita nel restante derma, preservandone la matrice. Al momento dell'impianto di questo sostituto dermico avverrà la migrazione dei fibroblasti e cellule endoteliali verso questa matrice che provvedono allaricostituzione del derma e alla sua vascolarizzazione. Successivamente