20 Downstream: l'isolamento dei prodotti di fermentazione

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

Lo scambio ionico consiste nello scambio di ioni tra due elettroliti (sostanze che si dissociano liberando ioni). Ai fini della purificazione di un metabolita dal mezzo di coltura si usano polimeri (come cellulosa, destrani, polistireni, poliacrilati, poliammine) che scambiano (sostituiscono) i propri ioni con altri del metabolita di interesse.

Solitamente si usa indicare i polimeri per lo scambio ionico con il nome di resine. Se si indica con R la resina e con "a" e "b" i due ioni che intervengono nel processo di scambio ionico, allora lo stesso può sinteticamente rappresentarsi con la seguente reazione: Ra + b ⇔ Rb + a

Gli ioni del polimero vengono sostituiti con ioni della stessa carica. Nel momento in cui un metabolita, ad esempio, cede i suoi ioni negativi a una resina, quest'ultima perde i suoi ioni negativi e acquista quelli del metabolita. Il metabolita, perdendo gli ioni negativi, si carica positivamente.

verrà attratto dalla resina. Questo tipo di resine sono resine scambiatrici cationiche. Le resine che scambiano ioni positivi, attraggono molecole che si sono caricate negativamente dopo lo scambio e si dicono scambiatrici anioniche. In una cromatografia a scambio ionico, come in una normale cromatografia, la fase stazionaria, rappresentata dalle resine in questo caso, è adsorbita sulle pareti della colonna cromatografica, lungo la quale discende il campione contenente i metaboliti di interesse. CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ La cromatografia di affinità è una tecnica che si basa sulle interazioni che si formano tra una sostanza (metabolita in questo caso) ed il relativo ligando associato alle pareti della colonna cromatografica tramite un braccio spaziatore (10-12 atomi di carbonio). Questa tecnica è schematizzabile in tre fasi: la prima consiste nell'aggiunta della miscela contenente il metabolita di interesse con formazione del legame tra ligando e metabolita,nella seconda fase si effettua la pulizia aggiungendo una opportuna soluzione di lavaggio che allontana le altre molecole presenti, mentre la terza fase consiste nella scissione del legame con il ligando ad opera dell'eluente, che permette di separare la sostanza interessata portandola in soluzione.

ADSORBIMENTO

Questa procedura è impiegata per separare proteine o altri metaboliti, sfruttando il fenomeno dell'assorbimento su matrici solide, per effetto della formazione di legami idrogeno e/o forze di van der Waals (in realtà il legame idrogeno è un esempio particolare di forza di van der Waals; in generale queste forze sono dei legami elettrostatici e cioè che si instaurano tra cariche di segno opposto). Una volta che sono stati adsorbiti i metaboliti di interesse su una matrice solida, questi stessi metaboliti devono essere riportati in soluzione e cioè staccati dalla matrice. Per fare questo si procede con un processo chiamato eluizione.

Un particolare di applicazione dell'adsorbimento è costituito dal recupero di due antibiotici: la streptomicina (antibatterico) e l'actidione (antifungino), prodotti contemporaneamente da Streptomyces griseus. La procedura prevede l'adsorbimento dell'actidione, ma non della streptomicina, su carbone attivo. In seguito, il filtrato colturale è fatto passare in una colonna di resina anionica, che lega la streptomicina. L'actidione è quindi eluito dal carbone attivo con acetone, mentre la streptomicina è eluita dalla resina.

GEL FILTRAZIONE

Questa procedura è basata sulla separazione delle singole molecole in base al peso. La separazione è tuttavia influenzata dalla forma della molecola, in quanto, a parità di peso, la struttura può essere ad esempio globulare (proteine) o lineare (polisaccaridi), con diverso comportamento nei riflessi della separazione. La gel filtrazione viene effettuata in colonna e la fase stazionaria è costituita da

polimeri acrilici, quali agarosio, cellulosa, destrani con porosità ben definita e chimicamente inerti. A livello di processi industriali, questa tecnica trova impiego nel frazionamento e nella purificazione di molecole ad alto valore aggiunto quali insulina e interferone.

ESTRAZIONE CON SOLVENTE

L'estrazione con solvente è una tecnica che viene utilizzata solitamente per separare da una miscela acquosa un soluto, purché poco solubile in acqua. A tal fine si sceglie un solvente insolubile in acqua ma capace di sciogliere il soluto. La miscela acquosa, contenente il soluto che si vuole isolare, viene miscelata con il solvente e agitata insieme in un imbuto separatore. L'imbuto separatore è un contenitore in vetro di forma conica chiuso in alto tramite un tappo e all'altra estremità presenta un tubo sottile dotato di rubinetto. All'interno dell'imbuto separatore i due liquidi si stratificano: sul fondo si depositerà il liquido

con maggiore densità, mentre in superficie rimane il liquido più leggero. Un particolare metodo dell'estrazione con solvente è l'controcorrente. Questo metodo è facilmente realizzabile in colonna, nella quale si fa entrare il solvente dal basso e il filtrato colturale lo si fa entrare dall'alto della colonna. Man mano che il solvente entra in contatto col campione estrae da quest'ultimo il metabolita che è solubile nel solvente. Un esempio di applicazione di tale procedura è costituita dal recupero della penicillina. *DISTILLAZIONE Questa procedura è impiegata per il recupero di metaboliti, quali l'etanolo. La distillazione consente di separare i componenti di una soluzione sfruttando la loro diversa volatilità (si intende la tendenza di una sostanza a evaporare: i liquidi con un basso punto di ebollizione hanno una elevata volatilità). I liquori come brandy, whisky edi ebollizione. I vapori che salgono nel tubo di vetro raggiungono una colonna di raffreddamento, dove si condensano e tornano allo stato liquido. Questo liquido condensato viene raccolto in un contenitore separato, mentre i vapori non condensati continuano a salire nella colonna di vetro. Questo processo di distillazione permette di separare i diversi componenti presenti nella miscela in base al loro punto di ebollizione. I componenti con un punto di ebollizione più basso si vaporizzano prima e vengono condensati, mentre quelli con un punto di ebollizione più alto rimangono nella miscela originale. La distillazione è un metodo molto utilizzato per la produzione di grappa e per separare i componenti del petrolio. Grazie a questo processo, è possibile ottenere prodotti puri e di alta qualità.di ebollizione dagli altri componenti presenti nella miscela. Per garantire una corretta distillazione, è importante mantenere la temperatura costante durante tutto il processo. Questo viene ottenuto grazie al condensatore, che si trova su un lato della colonna di vetro lungo cui salgono i vapori. Il condensatore è costituito da un cilindro interno, all'interno del quale si trova un tubo più stretto in cui confluiscono i vapori provenienti dalla colonna di vetro. Questo tubo è circondato da una camicia esterna, attraverso la quale scorre acqua fredda. L'effetto di questa configurazione è che l'acqua mantiene bassa la temperatura del tubo interno, permettendo ai vapori di condensare quando entrano in contatto con le pareti fredde. I vapori condensati ritornano allo stato liquido e vengono raccolti in un pallone di raccolta. In questo modo avviene la distillazione, che permette la separazione del componente con il punto di ebollizione più basso dagli altri componenti presenti nella miscela.Bollente della miscela da tutto il resto. Continuando si può procedere alla separazione del secondo componente (per ordine di punto di ebollizione) della miscela e così via. In genere dalla raccolta effettiva vengono scartate la testa e la coda di distillazione, cioè le prime e le ultime gocce della frazione distillata perché sono quelle che con ogni probabilità contengono un maggior grado di impurità. La tendenza delle molecole di un liquido a passare allo stato gassoso (e, quindi, a evaporare) è definita tensione di vapore (o tensione di vapore o più propriamente pressione di vapore saturo). Più nello specifico, questo parametro può essere definito come la pressione esercitata dalle molecole che evaporano da un liquido in un recipiente chiuso sul liquido stesso dal quale evaporano. Se un soluto non volatile viene sciolto in un liquido, ad esempio acqua, diminuisce la tendenza delle molecole dell'acqua (il solvente) ad evaporare.

abbandonare la soluzione e a passare allo stato divapore. La pressione di vapore della soluzione 8acqua più soluto poco volatile) è,quindi, più bassa dell’acqua pure (solo acqua). Il fenomeno descritto è regolato dallalegge di Raoult : la tensione di vapore di una soluzione è direttamenteproporzionale alla frazione molare (concentrazione del solvente). In terminimatematici: p p X=soluzione solvente solventein cui:p = tensione di vapore dela soluzione;soluzionep = tensione di vapore del solvente puro;solventeX = frazione molare del solvente.solventeAttraverso un esempio possiamo chiarire questo passaggio importante percomprendere a pieno quello che succede durante la distillazione e come potermigliorare l’efficienza del processo stesso. Supponiamo di avere una miscela di A e B.La tensione di vapore di A allo stato puro, a 100°C, è pari a 1000mmHg mentrequella di B nelle stesse condizioni è pari a 400mmHg. Supponiamo in

oltre che lamiscela sia equimolare in A e B percui entrambe le frazioni molari sono pari a 0.5. Da questi dati possiamo calcolare la pressione di vapore dei due componenti ed in particolare PA= (1000*0.5)= 500 e PA= (520*0.5)= 260. La pressione totale del sistema è pari a 760mmHg quindi se la pressione esterna è pari a 760mmHg la miscela inizierà a bollire. Possiamo ricavare la composizione del vapore che risulterà avere la composizione: χA= (500/760)= 0.67, χB= (260/760)= 0.33 (dove χA e χB rappresentano la frazione molare dei due componenti. Matematicamente così si dimostra che la fase di vapore è più ricca del componente più basso bollente. Quindi, da questo possiamo dedurre che il vapore che si forma ha una composizione diversa rispetto alla soluzione iniziale. Consideriamo, ora, una miscela di due liquidi A e B che viene riscaldata. Dalla fase liquida si formerà un vapore che, come detto, ha una composizione.