2 parte Zoologia 5

LINEA MASCHILE).

Il trasferimento di embrioni – biotecnologie di II generazione - ha rappresentato la

prima possibilità di moltiplicare i nati in modo consistente (selezione sulla LINEA

FEMMINILE). Il trasferimento di embrioni nella specie bovina è stato abbinato alla

superovulazione (MOET) e alla induzione dei cicli (che ha reso l’ET molto versatile nei

tempi di applicazione).

Il presupposto è che esistano femmine con potenzialità produttive al di sopra della

media che possano essere sfruttate come donatrici di embrioni (o ovuli) e che bovine

geneticamente inferiori possano essere usate come riceventi di embrioni e quindi

come incubatrici naturali.

Trapianto embrionale o trasferimento degli embrioni (bovini da latte) costo elevato

euro 300 embrione/trapiantato Soggetti coinvolti: Vacca donatrice: soggetto che

mette a disposizione gli embrioni. Caratteristiche: elevato VG, sane stato ginecologico

perfetto.

Vacche riceventi: soggetti sui quali sono impiantati gli embrioni. Caratteristiche: sane,

ben sviluppate, ginecologicamente in ordine.

Fasi:

Prelievo embrioni da donatrice 6-8 gg dopo inseminazioneCatetere inserito in vagina

e sonda in utero, soluzione fisiologica per lavaggio e recupero embrioni (30 min.)

Valutazione embrioniControllo al microscopio grandezza, colore, stadio di sviluppo

valutazione: 1. Eccellente, 2.buono, 3.scarso, 4.morto

Preparazione riceventi

Sincronizzazione con PGF2a In sincronia con donatrice con ET dopo il prelievo In tempi

diversi con embrioni congelati

Trasferimento embrioniDeposizione in utero con siringa, stessa fase del ciclo (7-8 gg

post estro)

Congelamento

Produzione di embrioni in vitro: DONATRICE: induzione ormonale alla superovulazione

OVUM PICK-UP con flushing

Fecondazione in vitro degli ovuli e formazione di embrioni Coltivazione degli embrioni

in vitro x 5-6gg RICEVENTE: sincronizzazione impianto dell’embrione

Produzione di embrioni nella donatrice: DONATRICE : induzione ormonale alla

superovulazione doppia IA EMBRYO PICK-UP con flushing 6-7 gg dopo IA

Coltivazione degli embrioni in vitro x 5-6gg

RICEVENTE: sincronizzazione e manifestazione del calore 6-7 gg prima dell’impianto

dell’embrione

SUPEROVULAZIONE

La superovulazione si ottiene con farmaci in grado di stimolare le ovaie della

donatrice ad una maturazione di più follicoli. I farmaci usati sono - FSH estratto dalle

ipofisi di maiale o pecora o ricombinante - HMG (Human Menopausal Gonadotropins)

estratto dalle urine di donna in menopausa FSH e HMG hanno azione mirata ma

occorrono somministrazioni 2 volte al giorno per 4/5 gg - eCG (equine Chorionic

Gonadotropin) estratto dal siero di cavalla gravida tra 40 -120°gg eCG ha una azione

più grossolana ma è sufficiente 1 sola somministrazione. Il trattamento più utilizzato è

quello con l’ FSH (elevato numero di follicoli ovarici che arrivano contemporaneamente

alla deiescenza/scoppio)

Trattamenti su animali giovani oppure ripetuti a lungo nel tempo possono avere degli

effetti collaterali negativi riducendo la fertilità delle donatrici o creando problemi a

carico della mammella (riduzione temporanea della produzione di latte, lassità del

legamento sospensore, ecc.) o delle ovaie (cisti ovariche). Donatrici con elevate

produzioni e/o in bilancio energetico negativo possono dare risultati scadenti, mentre

gli animali in asciutta danno in genere dei risultati più consistenti.

SINCRONIZZAZIONE TRA DONATRICE E RICEVENTE

La sincronizzazione dei cicli tra donatrice e ricevente può essere ottenuta imponendo

alle riceventi la lisi del CL iniettando PgF2α o applicando il PRID con Progesterone.

-La PgF2α lisa il CL recettivo e fa ripartire la funzionalità ovarica e in 24/48 ore

vedremo comparire i primi segni di calore nelle riceventi.

-Il progesterone a lento rilascio (impianto con Progesterone collocato sottocute alla

base dell’orecchio oppure in una spirale plastica (PRID) inserita nella vagina “inganna”

il sistema endocrino della bovina ricevente e mima l’esistenza di un CL funzionante.

Sono necessari 8 giorni di permanenza dell’Impianto o della spirale. La rimozione

dell’impianto o della spirale fa abbassare i tassi ematici di Progesterone e la lisi del CL

fa ripartire la maturazione follicolare.

INSEMINAZIONE ARTIFICIALE DELLA DONATRICE (per EMBRYO PICK-UP)

Per avere embrioni dalla donatrice occorre eseguire la IA con le consuete modalità e

nel rispetto delle misure igieniche. Viene però consigliata una DOPPIA IA (alcuni

protocolli indicano addirittura 3 IA) a distanza di 6/8 ore una dall’altra poiché con la

superovulazione molti follicoli maturano in rapida successione quindi il numero di

spermatozoi disponibili va aumentato e distribuito in un arco di tempo più lungo.

LAVAGGIO DELL’UTERO O FLUSHING per EMBRYO PICK-UP

Il recupero degli embrioni presenti all’interno dell’utero viene effettuato lavando la

cavità uterina al giorno 6/7 dopo la IA con una speciale soluzione fisiologica (PBS

Dulbecco - tampone fosfato).

Nella bovina gli embrioni impiegano circa 5 gg per raggiungere uno sviluppo adeguato

al trasferimento e discendere in utero. Per il lavaggio dell’utero si usa la via trans-

cervicale e sono usati strumenti adeguati: dilatatore, catetere di gomma da flushing

viene posizionato all’interno del corno uterino e viene ancorato gonfiandone il

palloncino Il catetere viene collegato a tubi di silicone con un raccordo ad Y che

permette da un lato ingresso del liquido dall’altro il deflusso. Quantità variabili di

liquido di lavaggio vengono immesse nella cavità uterina fino a distenderne le pareti;

per via trans rettale l’operatore valuta il grado di riempimento del corno, sospende

l’introduzione del liquido e apre la via di deflusso. Questa operazione viene ripetuta

diverse volte per ciascuna delle due corna uterine. Il liquido di lavaggio che contiene

gli embrioni può essere raccolto in una bottiglia sterile oppure può essere filtrato ed

eliminato. Gli embrioni, che sono più grandi dei pori della membrana filtrante,

rimangono all’interno del filtro con un modesto quantitativo di liquido e vengono

trasferiti in laboratorio

In media si raccolgono 5-6 embrioni (1/3 delle donatrici non risponde al trattamento,

1/3 produce da 1 a 3 embrioni e 1/3 produce oltre 3 embrioni). Il trattamento può

essere ripetuto ad intervalli di 6-8 settimane.

RICERCA degli EMBRIONI

Il contenuto del filtro viene rovesciato in una capsula Petri di forma quadrata e con

fondo quadrettato e osservato al microscopio stereoscopico a basso ingrandimento. La

membrana che circonda le cellule embrionali ha la capacità di rifrangere la luce e gli

embrioni si evidenziano per questa rifrangenza.

La MORFOLOGIA degli embrioni permette di riconoscere lo STADIO di SVILUPPO e la

QUALITA’ ed INTEGRITA’ degli stessi.

TRASFERIMENTO degli EMBRIONI

Possono essere trasferiti nell’utero di una bovina ricevente che sia stata sincronizzata

e andata in calore 6 o 7 giorni prima In questo caso ci sarà un CL funzionante di

dimensioni adeguate alla fase del ciclo e l’elevato tasso di progesterone ematico

permetterà all’embrione di procedere nello sviluppo. Gli embrioni possono essere

trasferiti FRESCHI oppure DOPO CONGELAMENTO e SCONGELAMENTO In ogni caso

l’embrione deve essere confezionato in una paillette da 0,25 ml all’interno di una

soluzione particolare.

Il trasferimento viene effettuato dopo aver eseguito l’anestesia epidurale, disinfettato

e asciugato i genitali esterni. La cervice va attraversata con molta cautela ed evitando

i traumatismi e l’embrione viene posizionato nel corno uterino corrispondente al CL.

Dopo 14 giorni si verifica l’assenza di manifestazioni estrali e dopo il 30° giorno si

esegue il controllo ecografico.

CONGELAMENTO di embrioni

Se l’embrione deve essere congelato necessita di una procedura particolare e

dell’addizione al terreno di coltura per l’embrione di un crioprotettore per evitare che il

cambiamento di stato dell’acqua cellulare determini un aumento di volume con rottura

delle membrane cellulari e che si formino dei cristalli di ghiaccio di forma acuminata.

Sono crioprotettori gli alcoli, (glicerolo, glicole etilenico) che sottraggono acqua alle

cellule e si sostituiscono a questa all’interno delle cellule, inoltre abbassano il punto di

cambiamento di stato dell’acqua (circa –6°/-7°C) dando luogo alla formazione di

cristalli di ghiaccio molto piccoli e rotondeggianti che non rompono le membrane

cellulari. Il congelamento avviene con una discesa molto lenta della temperatura

(decimi di grado) e viene controllata mediante un programma computerizzato. Arrivati

alla T° di –35°C la discesa della temperatura viene interrotta e la paillet contenente

l’embrione viene immersa direttamente in Azoto liquido alla temperatura di –196°C. A

questa temperatura viene mantenuto indefinitamente in condizione di IBERNAZIONE e

conserva la capacità di rivitalizzarsi al momento della scongelamento.

SCONGELAMENTO di embrioni

Lo scongelamento avviene in modo del tutto analogo a quello del materiale seminale.

La paillette viene estratta dall’Azoto liquido e viene subito immersa in acqua a 30-

35°C. Dopo circa 1 minuto viene estratta, asciugata e montata su di una specifica

pistolet per il trasferimento nella femmina ricevente.

OVUM PICK UP – BOVINO SENZA SUPEROVULAZIONE secondo AVANTEA

La tecnica Ovum Pick Up consiste nel prelievo per via transvaginale degli ovociti

tramite aspirazione dei follicoli ovarici con l’ausilio di una sonda ecografica SENZA

SUPEROVULAZIONE.

Questa procedura è assolutamente innocua per la donatrice, il tempo necessario per il

prelievo è di 15-20 minuti durante i quali la donatrice è contenuta in un travaglio.

Gli ovociti prelevati vengono selezionati in laboratorio e trasferiti in incubatore in un

terreno di coltura idoneo per completare la fase di maturazione.

Il giorno successivo al prelievo gli ovociti sono fecondati in vitro con il seme del toro

prescelto e mantenuti in incubatore per circa 6-7gg fino al raggiungimento dello stadio

di embrioni idonei per il trasferimento in bovine riceventi o per il congelamento.

Ovum pick up (OPU) e fecondazione in vitro OBIETTIVO: specie rare >

figli/femmina/anno Tecnica riproduttiva ultimi 10 anni (ecografo-intervento non

chirurgico)

Raccolta di 3-10 oociti frequenza 1/W vacche non stimolate possibile recupero anche

su vacche gravide (sino al 3° mese di gestazione); inseminazione; IVF in coltura di

spermatozoi 30 oociti in 4 gocce sperma; Incubazione oociti fecondati stadio di

blastocisti; Classificazione (sviluppo) 1. Cumulo ooforo 2. parziale granulosa 3. Senza

granulosa 1 e 2