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LINEA MASCHILE).
Il trasferimento di embrioni – biotecnologie di II generazione - ha rappresentato la
prima possibilità di moltiplicare i nati in modo consistente (selezione sulla LINEA
FEMMINILE). Il trasferimento di embrioni nella specie bovina è stato abbinato alla
superovulazione (MOET) e alla induzione dei cicli (che ha reso l’ET molto versatile nei
tempi di applicazione).
Il presupposto è che esistano femmine con potenzialità produttive al di sopra della
media che possano essere sfruttate come donatrici di embrioni (o ovuli) e che bovine
geneticamente inferiori possano essere usate come riceventi di embrioni e quindi
come incubatrici naturali.
Trapianto embrionale o trasferimento degli embrioni (bovini da latte) costo elevato
euro 300 embrione/trapiantato Soggetti coinvolti: Vacca donatrice: soggetto che
mette a disposizione gli embrioni. Caratteristiche: elevato VG, sane stato ginecologico
perfetto.
Vacche riceventi: soggetti sui quali sono impiantati gli embrioni. Caratteristiche: sane,
ben sviluppate, ginecologicamente in ordine.
Fasi:
Prelievo embrioni da donatrice 6-8 gg dopo inseminazioneCatetere inserito in vagina
e sonda in utero, soluzione fisiologica per lavaggio e recupero embrioni (30 min.)
Valutazione embrioniControllo al microscopio grandezza, colore, stadio di sviluppo
valutazione: 1. Eccellente, 2.buono, 3.scarso, 4.morto
Preparazione riceventi
Sincronizzazione con PGF2a In sincronia con donatrice con ET dopo il prelievo In tempi
diversi con embrioni congelati
Trasferimento embrioniDeposizione in utero con siringa, stessa fase del ciclo (7-8 gg
post estro)
Congelamento
Produzione di embrioni in vitro: DONATRICE: induzione ormonale alla superovulazione
OVUM PICK-UP con flushing
Fecondazione in vitro degli ovuli e formazione di embrioni Coltivazione degli embrioni
in vitro x 5-6gg RICEVENTE: sincronizzazione impianto dell’embrione
Produzione di embrioni nella donatrice: DONATRICE : induzione ormonale alla
superovulazione doppia IA EMBRYO PICK-UP con flushing 6-7 gg dopo IA
Coltivazione degli embrioni in vitro x 5-6gg
RICEVENTE: sincronizzazione e manifestazione del calore 6-7 gg prima dell’impianto
dell’embrione
SUPEROVULAZIONE
La superovulazione si ottiene con farmaci in grado di stimolare le ovaie della
donatrice ad una maturazione di più follicoli. I farmaci usati sono - FSH estratto dalle
ipofisi di maiale o pecora o ricombinante - HMG (Human Menopausal Gonadotropins)
estratto dalle urine di donna in menopausa FSH e HMG hanno azione mirata ma
occorrono somministrazioni 2 volte al giorno per 4/5 gg - eCG (equine Chorionic
Gonadotropin) estratto dal siero di cavalla gravida tra 40 -120°gg eCG ha una azione
più grossolana ma è sufficiente 1 sola somministrazione. Il trattamento più utilizzato è
quello con l’ FSH (elevato numero di follicoli ovarici che arrivano contemporaneamente
alla deiescenza/scoppio)
Trattamenti su animali giovani oppure ripetuti a lungo nel tempo possono avere degli
effetti collaterali negativi riducendo la fertilità delle donatrici o creando problemi a
carico della mammella (riduzione temporanea della produzione di latte, lassità del
legamento sospensore, ecc.) o delle ovaie (cisti ovariche). Donatrici con elevate
produzioni e/o in bilancio energetico negativo possono dare risultati scadenti, mentre
gli animali in asciutta danno in genere dei risultati più consistenti.
SINCRONIZZAZIONE TRA DONATRICE E RICEVENTE
La sincronizzazione dei cicli tra donatrice e ricevente può essere ottenuta imponendo
alle riceventi la lisi del CL iniettando PgF2α o applicando il PRID con Progesterone.
-La PgF2α lisa il CL recettivo e fa ripartire la funzionalità ovarica e in 24/48 ore
vedremo comparire i primi segni di calore nelle riceventi.
-Il progesterone a lento rilascio (impianto con Progesterone collocato sottocute alla
base dell’orecchio oppure in una spirale plastica (PRID) inserita nella vagina “inganna”
il sistema endocrino della bovina ricevente e mima l’esistenza di un CL funzionante.
Sono necessari 8 giorni di permanenza dell’Impianto o della spirale. La rimozione
dell’impianto o della spirale fa abbassare i tassi ematici di Progesterone e la lisi del CL
fa ripartire la maturazione follicolare.
INSEMINAZIONE ARTIFICIALE DELLA DONATRICE (per EMBRYO PICK-UP)
Per avere embrioni dalla donatrice occorre eseguire la IA con le consuete modalità e
nel rispetto delle misure igieniche. Viene però consigliata una DOPPIA IA (alcuni
protocolli indicano addirittura 3 IA) a distanza di 6/8 ore una dall’altra poiché con la
superovulazione molti follicoli maturano in rapida successione quindi il numero di
spermatozoi disponibili va aumentato e distribuito in un arco di tempo più lungo.
LAVAGGIO DELL’UTERO O FLUSHING per EMBRYO PICK-UP
Il recupero degli embrioni presenti all’interno dell’utero viene effettuato lavando la
cavità uterina al giorno 6/7 dopo la IA con una speciale soluzione fisiologica (PBS
Dulbecco - tampone fosfato).
Nella bovina gli embrioni impiegano circa 5 gg per raggiungere uno sviluppo adeguato
al trasferimento e discendere in utero. Per il lavaggio dell’utero si usa la via trans-
cervicale e sono usati strumenti adeguati: dilatatore, catetere di gomma da flushing
viene posizionato all’interno del corno uterino e viene ancorato gonfiandone il
palloncino Il catetere viene collegato a tubi di silicone con un raccordo ad Y che
permette da un lato ingresso del liquido dall’altro il deflusso. Quantità variabili di
liquido di lavaggio vengono immesse nella cavità uterina fino a distenderne le pareti;
per via trans rettale l’operatore valuta il grado di riempimento del corno, sospende
l’introduzione del liquido e apre la via di deflusso. Questa operazione viene ripetuta
diverse volte per ciascuna delle due corna uterine. Il liquido di lavaggio che contiene
gli embrioni può essere raccolto in una bottiglia sterile oppure può essere filtrato ed
eliminato. Gli embrioni, che sono più grandi dei pori della membrana filtrante,
rimangono all’interno del filtro con un modesto quantitativo di liquido e vengono
trasferiti in laboratorio
In media si raccolgono 5-6 embrioni (1/3 delle donatrici non risponde al trattamento,
1/3 produce da 1 a 3 embrioni e 1/3 produce oltre 3 embrioni). Il trattamento può
essere ripetuto ad intervalli di 6-8 settimane.
RICERCA degli EMBRIONI
Il contenuto del filtro viene rovesciato in una capsula Petri di forma quadrata e con
fondo quadrettato e osservato al microscopio stereoscopico a basso ingrandimento. La
membrana che circonda le cellule embrionali ha la capacità di rifrangere la luce e gli
embrioni si evidenziano per questa rifrangenza.
La MORFOLOGIA degli embrioni permette di riconoscere lo STADIO di SVILUPPO e la
QUALITA’ ed INTEGRITA’ degli stessi.
TRASFERIMENTO degli EMBRIONI
Possono essere trasferiti nell’utero di una bovina ricevente che sia stata sincronizzata
e andata in calore 6 o 7 giorni prima In questo caso ci sarà un CL funzionante di
dimensioni adeguate alla fase del ciclo e l’elevato tasso di progesterone ematico
permetterà all’embrione di procedere nello sviluppo. Gli embrioni possono essere
trasferiti FRESCHI oppure DOPO CONGELAMENTO e SCONGELAMENTO In ogni caso
l’embrione deve essere confezionato in una paillette da 0,25 ml all’interno di una
soluzione particolare.
Il trasferimento viene effettuato dopo aver eseguito l’anestesia epidurale, disinfettato
e asciugato i genitali esterni. La cervice va attraversata con molta cautela ed evitando
i traumatismi e l’embrione viene posizionato nel corno uterino corrispondente al CL.
Dopo 14 giorni si verifica l’assenza di manifestazioni estrali e dopo il 30° giorno si
esegue il controllo ecografico.
CONGELAMENTO di embrioni
Se l’embrione deve essere congelato necessita di una procedura particolare e
dell’addizione al terreno di coltura per l’embrione di un crioprotettore per evitare che il
cambiamento di stato dell’acqua cellulare determini un aumento di volume con rottura
delle membrane cellulari e che si formino dei cristalli di ghiaccio di forma acuminata.
Sono crioprotettori gli alcoli, (glicerolo, glicole etilenico) che sottraggono acqua alle
cellule e si sostituiscono a questa all’interno delle cellule, inoltre abbassano il punto di
cambiamento di stato dell’acqua (circa –6°/-7°C) dando luogo alla formazione di
cristalli di ghiaccio molto piccoli e rotondeggianti che non rompono le membrane
cellulari. Il congelamento avviene con una discesa molto lenta della temperatura
(decimi di grado) e viene controllata mediante un programma computerizzato. Arrivati
alla T° di –35°C la discesa della temperatura viene interrotta e la paillet contenente
l’embrione viene immersa direttamente in Azoto liquido alla temperatura di –196°C. A
questa temperatura viene mantenuto indefinitamente in condizione di IBERNAZIONE e
conserva la capacità di rivitalizzarsi al momento della scongelamento.
SCONGELAMENTO di embrioni
Lo scongelamento avviene in modo del tutto analogo a quello del materiale seminale.
La paillette viene estratta dall’Azoto liquido e viene subito immersa in acqua a 30-
35°C. Dopo circa 1 minuto viene estratta, asciugata e montata su di una specifica
pistolet per il trasferimento nella femmina ricevente.
OVUM PICK UP – BOVINO SENZA SUPEROVULAZIONE secondo AVANTEA
La tecnica Ovum Pick Up consiste nel prelievo per via transvaginale degli ovociti
tramite aspirazione dei follicoli ovarici con l’ausilio di una sonda ecografica SENZA
SUPEROVULAZIONE.
Questa procedura è assolutamente innocua per la donatrice, il tempo necessario per il
prelievo è di 15-20 minuti durante i quali la donatrice è contenuta in un travaglio.
Gli ovociti prelevati vengono selezionati in laboratorio e trasferiti in incubatore in un
terreno di coltura idoneo per completare la fase di maturazione.
Il giorno successivo al prelievo gli ovociti sono fecondati in vitro con il seme del toro
prescelto e mantenuti in incubatore per circa 6-7gg fino al raggiungimento dello stadio
di embrioni idonei per il trasferimento in bovine riceventi o per il congelamento.
Ovum pick up (OPU) e fecondazione in vitro OBIETTIVO: specie rare >
figli/femmina/anno Tecnica riproduttiva ultimi 10 anni (ecografo-intervento non
chirurgico)
Raccolta di 3-10 oociti frequenza 1/W vacche non stimolate possibile recupero anche
su vacche gravide (sino al 3° mese di gestazione); inseminazione; IVF in coltura di
spermatozoi 30 oociti in 4 gocce sperma; Incubazione oociti fecondati stadio di
blastocisti; Classificazione (sviluppo) 1. Cumulo ooforo 2. parziale granulosa 3. Senza
granulosa 1 e 2