2 parte Zoologia 4

ACETAMIDE

Tutti sono PERMEABILI e di BASSA TOSSICITA’ per le cellule spermatiche

Il confezionamento può essere fatto da appositi macchinari in:

pellets - gocce

pailettes - mini 0,25 ml - medie 0,5 ml

fiale - 1 ml

minitubes - volumi > 5ml

tubi/mini-bottle - volumi > 10-15 ml

liofilizzato - solo sperimentale

CONSERVAZIONE : T ambiente dosi da usare entro 24 h T; refrigerazione a 3-4°C

dosi usabili entro 3-4 gg; T congelamento a -79°C dosi usabili entro 6-8-12 mesi a

-196°C dosi conservabili illimitatamente.

La crioconservazione in veterinaria

il trattamento con il freddo permette di stoccare le cellule animali conservando le

indefinitamente e mantenendo inalterate caratteristiche vitalità

CO2 solida -79°C

N2 LIQUIDA – 196°C

il freddo anche un’azione lesiva sulle cellule. La pratica del congelamento non è così

facile come si può pensare, in quanto il passaggio da +36 a -196°C, se non effettuato

correttamente, può determinare la comparsa dei danni cellulari irreversibili che

compromettono la vitalità degli spermatozoi pregiudicano drasticamente la fertilità del

materiale seminale.

L’abbassamento della temperatura provoca modificazioni nella conformazione della

membrana cellulare, progressivo aumento della solubilità del gas con aumento delle

pressioni parziali di co2 o2 N2 e formazione di cristalli di ghiaccio intra d’extracellulare

con punte acuminate.

Se le cellule sono congelate troppo rapidamente, l’acqua non riesce ad uscire

rapidamente congela l’interno con morte delle cellule.

Se le cellule sono congelate troppo lentamente il volume si riduce troppo per la

massiccia disidratazione e la lunga esposizione ad elevata concentrazione di soluto i

danni delle strutture cellulari.

Se il congelamento sufficientemente graduale la perdita di acqua sufficiente

concentrare i soluti intracellulari e la cellula si disidrata senza congelare all’interno.

CONGELAMENTO E STOCCAGGIO

Il congelamento e lo stoccaggio delle dosi (in pailettes), sono le ultime due attività che

chiudono il processo produttivo del seme nei centri di F.A.

Per ridurre al minimo l’incidenza dei danni da congelamento si effettuano sempre due

azioni: · aggiunta del crioprotettore (tipo glicerolo) al mestruo diluitore · rispetto delle

specifiche curve/rampe di discesa della T (“rampe” specifiche ed ottimali per ogni

specie)

Possono essere congelati

· EIACULATO COMPLETO

· SPERMATOZOI DOPO SEPARAZIONE DEL PLASMA SEMINALE

· SPERMATOZOI EPIDIDIMARI

· FRAMMENTI DI TESSUTO TESTICOLARE

Gli SPERMATOZOI in campo veterinario sono le cellule più largamente congelate. Il

primo esperimento si deve a Poldge nel 1949.

Lo STOCCAGGIO del seme congelato avviene nella specie bovina tramite pailettes, del

volume di 0,25/0,50 ml, che riempite vengono sigillate dopo essere state esposte ai

vapori di N liquido(congelate!) vengono raccolte in specifici raccoglitori (coblet) messi

poi in immersione in bidoni specifici nei quali N2 liquido sarà sempre mantenuto a

livello controllato. L’adeguatezza di tutto il processo di congelamento del seme, viene

solitamente valutata tramite un indice espresso dalla % di ritorno alla motilità o fattore

di criospermia (CSF): % sptz mobili post-scongelamento/% sptz mobili pre-

congelamento * 100 Un buon CSF e` ≥ al 50%!

ATTITUDINE AL CONGELAMENTO DEL SEME DI SPECIE ZOOTECNICHE

bovino: il più largamente sfruttato, la metodica più standardizzata, autori selezionati

per congelati vita del seme.

Cavallo: largo uso solo recente, metodica variabile, plasma seminale eliminato con

centrifugazione, elevata variabilità individuale.

Suino: praticamente non congelabile, la metodica variabile, secreto delle ghiandole

bulbo uretrali eliminato con filtrazione, elevata variabilità individuale.

Ovi caprini: abbastanza utilizzato, metodica standardizzata, inseminazione

laparoscopica.

Coniglio: ancora poco utilizzato, metodica non standardizzata, induzione

dell’ovulazione.

Cane: poco utilizzato, metodica abbastanza standardizzata.

Gatto: poco utilizzato, metodica non standardizzata

Chi produce seme sessato in IT? SemenItaly ABS Italy GenoItaly etc etc ma anche

centri privati (Chiacchierini PG)

Tutte strutture hanno creato le migliori condizioni ambientali ed acquisite

strumentazioni di alto livello tecnologico per ottenere un prodotto di altissima qualità.

Molte strutture sono collegate a società USA SEXING TECHNOLOGIES INC, Texas,

detentrice della tecnologia per il sessaggio del seme.

La tecnologia che si usa per la produzione del seme sessato è stata messa a punto

negli Stati Uniti in joint-venture da USDA (U.S. Dept of Agriculture = Ministero

dell’Agricoltura), Colorado State University e XY Inc, poi coperta dal brevetto N.

5135759 noto come “brevetto Johnson” da nome del suo inventore.

Le strumentazioni che consentono la separazione degli spermatozoi sono i separatori

MO-FLO o CITOFLUORIMETRI A FLUSSO che all’inizio sfruttavano la tecnologia

analogica, adesso quella digitale e sono più precise e veloci, ed in grado di separare

più cellule seminali per unità di tempo ed avere meno scarti.

Il principio su cui si basa la separazione degli spermatozoi è da ricondurre nei

mammiferi alla presenza degli eterocromosomi (cromosomi sessuali): se lo

spermatozoo porta il crm X si determina (per fusione con l’ovocellula X) il sesso

femminile se lo spermatozoo porta il crm Y si determina (per fusione con l’ovocellula

X) il sesso maschile.

Il cromosoma X e molto più grande del cromosoma Y. Questo fatto fa sì che lo

spermatozoo che contiene il cromosoma X abbia un quantitativo di DNA maggiore lo

spermatozoo contenente il cromosoma Y contiene invece meno DNA.

Nei bovini questa differenza è del 3,8% e viene sfruttata per il processo di

separazione.

Il processo di separazione prevede una preventiva fase preparativa specifica: il

campione di seme viene messo a contatto con un colorante sopravitale (che non

danneggia la vitalità degli spermatozoi) e che penetra negli spermatozoi ed avendo

una particolare affinità per il DNA si lega ad esso. Più alta è la quantità di DNA nello

spermatozoo e più colorante rimarrà legato.

Il colorante utilizzato inoltre è fluorescente e quando è colpito da un raggio laser

emette una luce.

Quindi gli spermatozoi con cromosoma X emettono più luce rispetto a quelli che

contengono il cromosoma Y e questa differenza nell’emissione di luce viene valutata

dal MO-FLO e serve per separare le due popolazioni di spermatozoi.

Tutti i tori possono essere sessati ma nella pratica occorre verificare come il seme si

comporta durante il processo di sessaggio e può capitare che alcuni tori abbiano un

seme che non si presta ad essere sessato efficacemente. Questo dipende da diversi

fattori quali concentrazione, motilità, percentuale di anomalie morfologiche, tutte

caratteristiche intrinseche al seme al momento del prelievo.

La maggioranza del seme di toro può essere sessato trovando per ogni campione/toro

la più efficace combinazione di lavorazione nei vari passaggi che caratterizzano questo

processo. NON TUTTI gli spermatozoi vengono correttamente identificati in base al

loro sesso ma dal seme sottoposto al processo di separazione si ottengono in effetti 3

tipi di popolazioni di spermatozoi:

femmine in misura del 20%,

maschi in misura del 20%

non identificati in misura del 60%

L’efficienza di questa tecnologia è quindi del 40%, solamente il 40% degli spermatozoi

viene effettivamente recuperato (se si parla di sptz con X sarà pari quindi al 20% degli

spermatozoi totali). L’accuratezza del processo di separazione è elevatissima e le dosi

prodotte contengono oltre il 90% di spermatozoi X, cioè femmine.

Il seme contenente spermatozoi maschili solitamente non viene messo in commercio

ma viene buttato.

Ogni dose di seme sessato Foemina –ad esempio- è prodotta secondo lo standard

qualitativo di Sexing Technologies che prevede che in ogni paillettes da 0,25 cc siano

contenuti almeno 2,1 milioni di spermatozoi dei quali almeno il 90% contenenti il

cromosoma sessuale X (femmina).

Questa quantità è inferiore rispetto a quanto contenuto normalmente in una dose di

seme convenzional poichè nel processo di separazione elimina tutti gli spermatozoi

anomali e/o morti prima del congelamento e quindi la percentuale di spermatozoi vivi

nella dose è significativamente superiore a quello del seme tradizionale.

Il basso numero di spermatozoi totali impone di seguire scrupolosamente il protocollo

suggerito dalla ditta per l’utilizzo.

Il seme sessato viene utilizzato solitamente su manze vergini, ben allevate e ben

sviluppate.

Per garantire i migliori risultati con il seme sessato è consigliato fecondare le manze

verso la fine del calore e non all’inizio. Quindi è indicato seguire la seguente

procedura: calore al mattino ed F.A. al pomeriggio calore al pomeriggio ed F.A. al

mattino successivo

Occorre seguire scrupolosamente le procedure per un corretto scongelamento:

- accertarsi che l’animale o gli animali da fecondare siano effettivamente in calore -

disposizione di un piano ampio e pulito dove effettuare lo scongelamento e la

preparazione del seme - eseguire le procedure nel rispetto delle più elementari norme

igieniche - utilizzare uno scongelatore termostato a 36°- 37°C per scongelare il seme

per almeno 30 secondi - asciugare bene le dosi scongelate - scongelare solo il numero

di paillettes che si ritiene di poter utilizzare entro i successi 15 minuti - portare la

pistolette alla stessa temperatura del seme scongelato e proteggerla da eventuali

shock termici

Se tutte le procedure vengono correttamente eseguite, la variazione nei tassi di

concepimento aziendale è molto limitata: vengono riportati diminuzioni del tasso di

concepimento del 10% - 15 % rispetto alla media aziendale. I risultati sono comunque

molto variabili anche in funzione del toro.

La percentuale di vitelli femmine che nasceranno dal seme sessato è pari al contenuto

di spermatozoi X nella dose, cioè oltre il 90%. Ovviamente, maggiore è il numero di

parti, maggiore la probabilità che le percentuali rilevate siano effettivamente quelle

attese, sia con seme tradizionale sia con seme sessato.

Quali i vantaggi dell’utilizzo del seme sessato?

La convenienza economica dell’utilizzo di seme sessato dipende da più fattori: -il

tasso di concepimento iniziale con il seme convenzionale (non sessato), -la riduzione

del concepimento (se esiste) utilizzando il seme sessato, -il differenziale di prezzo tra