Che materia stai cercando?

2 parte Zoologia 4

in questi appunti c'è la descrizione della fecondazione artificiale, vantaggi e svantaggi, come viene prelevato il seme, come viene sessato, metodi, all'esame viene sempre fatta una domanda su questa parte. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Pasquini dell’università degli Studi del Politecnico delle Marche - Univpm. Scarica il file in... Vedi di più

Esame di Zootecnica docente Prof. M. Pasquini

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

Subito dopo la raccolta del seme vengono effettuate

LE ANALISI che possiamo suddividere in: · Macroscopiche (o “valutazione a finestra”) ·

Microscopiche/funzionali

L’esame macroscopico si effettua senza l’ausilio di alcuna strumentazione, ed e` volto

alla rilevazione di tutti quei parametri giudicabili ad occhio nudo, come: Volume:

varia con la specie, l’età del soggetto, la stagione e il regime di raccolta; Colore: da

bianco traslucido, a bianco-grigio a bianco-crema; può essere giallastro per la

presenza di pigmenti come le xantine, normalmente assunte dall’animale con la dieta

giornaliera. Sono da escludere dalla lavorazione seme con colorazioni verdastre

(presenza di pus, e quindi indice di patologie latenti) e rosate (presenza di sangue e

quindi indice di lesioni recenti a carico dell’apparato genitale del donatore);

Consistenza: da latteo-acquoso a latteo-denso a latteo-cremoso a cremoso, varia in

rapporto alla concentrazione di cellule spermatiche rispetto al volume di liquido

testicolare, epididimario e al secreto delle ghiandole accessorie;

Odore: pressoché inodore.

Gli esami microscopico/funzionali invece si effettuano utilizzando strumentazioni più o

meno sofisticate: Microscopio a basso ingrandimento (100X) con tavolino

riscaldato e con vetrini riscaldati per valutare la Motilità di massa: una goccia di circa

50 µl a forma di virgola, senza coprioggetto.

Si deve rilevare la formazione di onde più o meno vorticose e scure.

Microscopio a elevato ingrandimento (200X – 400X e oltre) sempre con tavolino

riscaldato e con vetrini riscaldati per valutare la Concentrazione: Numero di

spermatozoi/ml di seme; Cinetica: insieme degli attributi del movimento degli

spermatozoi rappresentati da motilità e velocità;

Citomorfologia: valutazione morfologica dello spermatozoo, volta alla verifica

dell’integrità delle strutture deputate al movimento e alla funzionalità.

Concentrazione: la determinazione della concentrazione(numero di spermatozoi/ unità

di volume) può essere effettuata attraverso mezzi manuali, semiautomatici o

completamente automatici.

1. Il conteggio manuale viene effettuato con ematocitometri, particolari vetrini

portò oggetto, dotati di camera interna con volume standard calibrato e disegno

superiore a scacchiera, che permettono in seguito contro manuale, la

rilevazione della concentrazione di spermatozoi e del liquidò seminale

analizzato.

Procedura: si diluisce lo sperma con uno spermicida (formalina, soluzione salina con

bicarbonato con cloramina ecc…) Il rapporto 1:20/1:100; inoltre effettuare una

colorazione del materiale seminale per facilitare la rilevazione microscopica di tutte le

cellule.

Si riempiono le camere dell’ematocitometro per capillarizzazione, e si attende la

sedimentazione per 10- 30 minuti in ambiente umido.

Si esegue il conteggio medio di cinque quadrati piccoli su quattro grandi, nei due

reticoli della camera di burker, per un totale di otto quadrati grandi; la distribuzione

degli spermatozoi dentro i reticoli della camera dovrebbe seguire una distribuzione di

poisson e poiché non risulta possibile accertare tale distribuzione durante la

valutazione ordinarie, vengono scartati nell’ambito degli otto conteggi eseguiti svolto

il più basso, in modo tale da approssimare maggiormente la media alla mediana della

distribuzione delle classi di frequenza delle conte ottimizzando il risultato.

Dato che la superficie di un quadrato piccolo e` 0,04mm2, l’altezza di un quadrato

piccolo e` 0,10mm, il volume di un quadrato e` 0,004mm3 e il volume di 5 quadrati

piccoli e` 0,02mm3, il calcolo della concentrazione viene eseguito utilizzando la

seguente formula:

C= N*(1/V5)*FD*FC

dove:

C = concentrazione spermatica / ml;

N = numero di spermi contati in 5 quadrati piccoli;

1 = riferimento ad 1 ml;

V5 = volume di 5 quadrati piccoli (1 / V5 consente il calcolo del numero di spermi in 1

mm3);

FD = fattore di diluizione (se 1:100 = 100);

FC = fattore di conversione (mm3 -> ml = 1000).

• ES. di calcolo su sperma di toro • Volume eiaculato: 5cc ; • Diluizione utilizzata:

1:100; • N: 393 • C=393*(1/0,02)*100*1000=1965000000 →1.960*10⁶

Tale metodo • poco costoso e di facile esecuzione, ma • presenta lo svantaggio di

possedere un elevato errore standard

2. Il conteggio semi-automatico viene effettuato con colorimetri o con fotometri;

· Il colorimetro e` un metodo facile da eseguire e molto economico, che sfrutta la

torbidita` dell’eiaculato (fresco) per stimare la sua concentrazione, ma presenta il

limite di essere estremamente approssimativo, per cui l’utilizzo e` giustificato solo a

livello aziendale e in quelle tipologie di allevamento (come quello suino) dove non e`

necessaria una scrupolosa stima della concentrazione di spermatozoi dal momento

che non si diluisce.

· Il fotometro e` uno strumento facile da utilizzare, che conta il numero di cellule

presenti in un campione a volume noto sfruttando la diversa assorbanza degli sptz in

presenza di un fascio di luce a lunghezza d’onda definita. Il valore che si ottiene (in

pochi minuti) presenta una notevole accuratezza se lo strumento è stato

opportunamente tarato. Il limite di questo strumento sta nella significativa perdita di

attendibilità, in caso di presenza di cellule patologiche nel materiale seminale, in

quanto non e` in grado di distinguerle dagli spermatozoi.

Il conteggio completamente automatico, viene effettuato invece con un complesso

analizzatore d’immagine dotato di softwere, detto C.A.S.A. (computer assisted sperm

analyzer) (Tardif et all. 1997).

Questo strumento d’analisi (molto costoso) permette di stimare con un’elevatissima

accuratezza la concentrazione del materiale seminale, rilevare altri parametri come

la motilità e la velocità degli spermi. · Il conteggio degli spermatozoi viene effettuato

attraverso l’elaborazione computerizzata delle resistenze elettriche dovute al

passaggio delle particelle del campione -una alla volta- attraverso un campo elettrico ·

La rilevazione della motilità e della velocità degli spermatozoi invece è permessa

attraverso lo studio delle immagini video a forte ingrandimento (relative ad una goccia

di liquido seminale), registrate e digitalizzate dal computer che riesce a rilevare fino a

60 fotogrammi al secondo (frames). L’analisi delle immagini in tal modo può essere

analizzata dal software che seguendo parametri imposti dall’operatore, valuta le

traiettorie, la velocità e la progressione degli spermatozoi.

Anche questa sofisticata tecnica di valutazione pero` presenta i suoi limiti, dovuti a:

· accuratezza dell’operatore nel protocollo di diluizione del seme prima dell’analisi; ·

precisione dell’operatore nel settaggio e taratura del software per la tipologia di seme

da analizzare (sostanziali differenze tra spermatozoi di diverse specie);

· soggettività con la quale vengono analizzate le videoregistrazioni relative al

movimento degli spermatozoi, in quanto se pur effettuate da un computer sono

sempre relative ai parametri di valutazione imposti dall’operatore al momento della

taratura.

VANTAGGI E SVANTAGGI DEI METODI DI CONTEGGIO:

1. Camera contaGlobuli – ematocitometro

Vantaggi: poco costoso e di facile esecuzione

Svantaggio: elevato errore standard

2. Colorimetro: sfrutta curve di lettura ottenuta attraverso la stima dell’assorbanza

ad una certa lunghezza d’onda di campioni a concentrazione nota.

Vantaggio: rapida lettura e alta attendibilità se tarato correttamente

Svantaggio: perdita di significatività se presenti molte cellule patologiche

3. contatore elettronico: determina la resistenza elettrica data dal passaggio delle

particelle, uno alla volta, nel campione attraverso un campo elettrico

vantaggio: molto curato

4. analizzatore computerizzato di immagini

vantaggio: accuratezza

svantaggio: costoso

citomorfologia: la valutazione della morfologia dello spermatozoo è finalizzato alla

verifica dell’integrità delle strutture deputate al movimento della funzionalità e cioè

alla rilevazione di anomalie potenzialmente in grado di ostacolare il raggiungimento

del sito di fecondazione, impedire la prenotazione dell’oocita o la decondensazione del

nucleo.

Tale valutazione condotta utilizzando sistemi di contrasto ottico microscopico

(microscopia in contrasto di fase o in contrasto interferenziale differenziale di

Nomarsky), previa fissazione in sospensione degli spermatozoi. È la valutazione meno

ripetibile, poiché è strettamente correlata al livello di esperienza dell’operatore. Questi

uno spermatozoo possa essere considerato normale è necessario che siano normali la

testa, il collo, il tratto intermedio è la coda dello spermatozoo.

I requisiti minimi di qualità del seme per tori in produzione presso centri I.A. sono:

· Concentrazione = 500 x 10⁶ spz/ml;

· 50% di motilità progressiva;

· 70% di spermatozoi morfologicamente normali.

Anche se questi requisiti non vengono soddisfatti il toro non può essere definito sterile,

ma non rispondente ai requisiti minimi richiesti; in altri termini, non conveniente

economicamente (poche dosi per I.A. e/o poche vacche gravide in monta libera).

Un riproduttore può essere, ragionevolmente, definito sterile solo di fronte alla totale

assenza di spermatozoi vitali nell’eiaculato (azoospermia o necrozoospermia).

Motilità: è una delle caratteristiche maggiormente correlate alla fertilità, in quanto

serve per:

l’attraversamento della cervice (Parametro ininfluente nell’inseminazione artificiale

della specie bovina, in quanto il materiale seminale viene immesso direttamente nel

primo tratto dell’utero)

l’attraversamento della giunzione utero tubarica

La penetrazione del cumulo ooforo

la penetrazione attraverso la zona pellucida.

Viene indicata come percentuale spermatozoi mobili (in soggetti normali dovrebbe

essere >= 70%)

Si distinguono in totale identificazione della percentuale di spermatozoi vivi

nell’eiaculato

Progressiva confronto di una serie di misurazioni relative al movimento degli

spermatozoi.

La rilevazione della motilita` totale (o tasso di vitalita`) viene effettuata con diversi

metodi: Con uso di colorazioni Post-vitali come l’eosina, la negrosina o il blu di bromo

fenolo, volte a colorare gli spermatozoi morti (si basano sul principio che le cellule

morte, che presentano una membrana danneggiata, trattengono determinati coloranti

come quelli appena menzionati!), rilevabili attraverso microscopia a contrasto di fase.

Con metodo di gravammo, che consiste nel far passare gli spermatozoi attraverso una

colonna di Sephadex contenente destrano. Gli spermatozoi morti con membrana

cellulare danneggiata, si legano al destrano e vengono trattenuti dalla colonna mentre

tutti gi altri passano senza alcun problema.

La rilevazione della motilita` progressiva invece viene effettuata attraverso l’analisi

delle registrazioni relative al movimento degli spermatozoi. Queste analisi possono

essere di tipo manuale o computerizzata: · Per le rilevazioni di tipo manuale si

utilizzano videoregistrazioni rallentate del movimento degli spermatozoi, che vengono

visionate da operatori che riportano i vari movimenti degli spermatozoi su un lucido. E’

questa però una metodica molto laboriosa ed estremamente soggettiva, in quanto la

sua accuratezza e` direttamente proporzionale alla sensibilità dell’operatore nella

trascrizione delle immagini e alla sua imparzialita` nella lettura dei lucidi. · La

valutazione computerizzata, invece e` effettuata da strumentazioni (CASA)

computerizzate dotate di schede digitalizzi che convertono il segnale della telecamera

in una matrice di punti. Tramite apposito software quindi è possibile individuare gli

spermatozoi e ricostruirne le tracce per unità di tempo.

La motilità degli spermatozoi, si sviluppa gradualmente durante la loro maturazione, e

dipende da:

· Proteine acquisite durante la maturazione epididimale (FMP= Forward motility

protein)

· Corretto rapporto tra secrezione delle ghiandole accessorie (il secreto delle

vescichette seminali inibisce la motilità e la vitalità degli spermatozoi, quello della

prostata invece stimola entrambi);

· Temperatura e pulizia di tutto il materiale di laboratorio che viene a contatto con il

seme.

E’ opportuno ricordare che: Gli spermatozoi perdono prima la capacità fertilizzante

rispetto alla motilità, quindi è possibile valutare uno spermatozoo motile quando non è

già più in grado di fertilizzare. Spermatozoi anormali possono essere mobili ed in grado

di fertilizzare un’oocita!

DILUIZIONE

La diluizione del seme può essere effettuata solo al termine del processo di

valutazione, in quanto per ottenere una dose standard occorre prima conoscere: · Il

NSPM necessari in una dose per assicurare il maggior successo in termini di fertilita`

(per la specie bovina tale parametro si aggira intorno agli 8-10⁶); · Il NSPM presenti

nell’eiaculato da diluire (nel caso si usino tecniche di valutazione non computerizzate

e che non danno l’immediata stima del NSPM) Il numero di spermi potenzialmente

fecondi si calcola tramite la seguente formula: NSPM= Concentrazione x ml di

eiaculato x motilità (~0,75) x normalità (~0,85)

Il diluitore detto mestruo e` una sostanza biocompatibile con il materiale seminale che

-permette di ottenere un numero elevato di dosi inseminative da un solo eiaculato,

-consente in caso di congelamento a -196 °C (N liquido) di non compromettere troppo

la vitalità degli spermatozoi (mestrui x congelamento). In generale un diluitore deve

essere: · Isotonico con le cellule seminali; · Dotato di un sistema tampone che moderi

la progressiva acidificazione del mezzo; · Dotato di capacità protettive per le

membrane cellulari; · Dotato di capacità nutritive (sostanze energizzanti); · Deve

contenere antibiotici con poter batteriostatico/battericida; · Deve contenere un

crioprotettore (solitamente glicerolo) per controllare la formazione di cristalli di

ghiaccio se le dosi saranno congelate

Alcune sostanze -permeabili e di bassa tossicità per gli spermatozoi- che variamente

combinate possono costituire un diluitore o mestruo per le diverse specie animali:

-Citrato trisodico, Acido citrico -Latte scremato trattato termicamente (Laiciphos) -TRIS

(idrossimetil-aminometano) -Tuorlo d’uovo (20%) -Zuccheri (fruttosio, lattosio) -Enzimi

(a-amilasi, ß-glucuronidasi, catalasi) -Antibiotici

(Penicillina/Streptomicina/Lincomicina/Spectinomicina) -Crioprotettore (Glicerolo a

concentrazione diversa) SI AGGIUNGE SOLO SE IL SEME VIENE CONGELATO Diluitori

per seme confezionati presenti sul mercato: Crioprotettori: GLICEROLO DI METIL

SULFOSSIDO GLICOLE ETILENICO METANOLO GLICOLE PROPILENICO DI METIL

ACETAMIDE

Tutti sono PERMEABILI e di BASSA TOSSICITA’ per le cellule spermatiche

Il confezionamento può essere fatto da appositi macchinari in:

pellets - gocce

pailettes - mini 0,25 ml - medie 0,5 ml

fiale - 1 ml

minitubes - volumi > 5ml

tubi/mini-bottle - volumi > 10-15 ml

liofilizzato - solo sperimentale

CONSERVAZIONE : T ambiente dosi da usare entro 24 h T; refrigerazione a 3-4°C

dosi usabili entro 3-4 gg; T congelamento a -79°C dosi usabili entro 6-8-12 mesi a

-196°C dosi conservabili illimitatamente.

La crioconservazione in veterinaria

il trattamento con il freddo permette di stoccare le cellule animali conservando le

indefinitamente e mantenendo inalterate caratteristiche vitalità

CO2 solida -79°C

N2 LIQUIDA – 196°C

il freddo anche un’azione lesiva sulle cellule. La pratica del congelamento non è così

facile come si può pensare, in quanto il passaggio da +36 a -196°C, se non effettuato

correttamente, può determinare la comparsa dei danni cellulari irreversibili che

compromettono la vitalità degli spermatozoi pregiudicano drasticamente la fertilità del

materiale seminale.

L’abbassamento della temperatura provoca modificazioni nella conformazione della

membrana cellulare, progressivo aumento della solubilità del gas con aumento delle

pressioni parziali di co2 o2 N2 e formazione di cristalli di ghiaccio intra d’extracellulare

con punte acuminate.


PAGINE

12

PESO

88.08 KB

AUTORE

met94

PUBBLICATO

5 mesi fa


DESCRIZIONE APPUNTO

in questi appunti c'è la descrizione della fecondazione artificiale, vantaggi e svantaggi, come viene prelevato il seme, come viene sessato, metodi, all'esame viene sempre fatta una domanda su questa parte. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Pasquini dell’università degli Studi del Politecnico delle Marche - Univpm. Scarica il file in formato PDF!


DETTAGLI
Esame: Zootecnica
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie agrarie
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher met94 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Zootecnica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Politecnico delle Marche - Univpm o del prof Pasquini Marina.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Zootecnica

9 - Apparato genitale maschile
Appunto
10 - Apparato Genitale Femminile
Appunto
10. 1 Apparato Genitale Femminile, 2
Appunto
11. Apparato ghiandolare mammario
Appunto