2 Le matrici per il confronto tra sequenze

Variabilità genetica

Gli organismi viventi, pur discendendo da un antenato comune, possiedono genomi abbastanza diversi tra loro. Questo dipende dagli errori che si verificano durante i processi di replicazione del DNA. Sebbene l’apparato di replicazione sia molto accurato, è possibile che si verifichino degli errori, ovvero mutazioni della sequenza di DNA, che possono poi essere “fissati” attraverso un processo casuale in tutta la popolazione degli individui di quella specie o in una larga frazione di essa.

Cambiamenti nel DNA

I cambiamenti possono essere dovuti a:

• Sostituzione di un nucleotide con un altro lungo la sequenza di DNA;
• Inserzioni di tratti più o meno lunghi di DNA;
• Delezioni di tratti più o meno lunghi di DNA;
• Riarrangiamenti di vario tipo.

Se gli errori vengono fissati si ha la creazione di nuove varianti geniche. Le variazioni genetiche, che sono il presupposto per l’evoluzione biologica, affinché possano risultare evolutivamente rilevanti devono poter essere trasmesse alla progenie e quindi gli errori devono interessare le cellule germinali. Il processo durante il quale la mutazione si propaga nella popolazione si definisce fissazione. La fissazione è completa quando il 100% della popolazione contiene l’allele mutato.

Processi di fissazione

Il fatto che una mutazione venga fissata all’interno di una popolazione può risultare da due processi distinti:

1. Selezione naturale: questo fenomeno prevede che la capacità di riproduzione di un individuo dipenda dal suo adattamento all’ambiente, cioè la sua riproduzione è tanto più favorita quanto più è adattato all’ambiente. La riproduzione di individui poco adattati è contrastata. Sulla base di questo concetto, la selezione naturale permette la fissazione di mutazioni vantaggiose a discapito di quelle svantaggiose e non ha alcuna influenza sulle mutazioni neutre (mutazioni che non causano cambiamenti a livello fenotipico).
2. Deriva genica casuale: questo fenomeno può favorire la fissazione di mutazioni neutre attraverso un processo puramente casuale che vede aumentare nel tempo la frequenza di un allele mutato fino alla sua fissazione nella popolazione.

Le tipologie di mutazioni che intervengono nel corso del processo di evoluzione molecolare sono:

• Le sostituzioni puntiformi: delezione e inserzione;
• Le inversioni.

L’avvento della genomica rende oggi possibile confrontare interi genomi o i suoi prodotti (trascrittomi o proteomi).

Confronto di due sequenze

Tradizionalmente, a partire dal lavoro pionieristico di Carlo Linneo, lo studio dell’evoluzione e delle relazioni tra organismi è stato condotto attraverso l’analisi dei caratteri morfologici. L’enorme quantità di dati di sequenze nucleotidiche e proteiche disponibili oggi nelle banche dati ha fatto sì che al classico approccio morfologico utilizzato nell’analisi filogenetica si affiancasse un approccio molecolare, basato sul confronto diretto delle sequenze disponibili per un dato organismo.

Qualora si abbiano a disposizione due sequenze di geni o proteine, il primo e fondamentale passo per studiare l’evoluzione delle due sequenze è stabilire se tra esse sussista una relazione di omologia (RICORDA: due geni si dicono omologhi se hanno in comune la sequenza, o perlomeno una buona percentuale di essa; in genere dovrebbero codificare per proteine con funzione simile; si trovano in organismi differenti e derivano da un antenato comune). Poiché, naturalmente, non è possibile seguire direttamente l’evoluzione di due o più sequenze, l’unico metodo di cui si dispone per stabilire una relazione di omologia è il confronto delle sequenze attraverso un allineamento.

Il problema che sta alla base della bioinformatica, però, è come confrontare e allineare due sequenze proteiche o nucleotidiche. In primo luogo è necessario capire che cosa significhi “confrontare” e “allineare” due sequenze. Questi termini indicano il confronto tra stringhe, dove con “stringa” si intende qualunque sequenza di simboli. “La bioinformatica è schifosa” è una stringa di caratteri; oppure “AATYKLTRFK” è una stringa di caratteri e così via. Per confrontare due stringhe, dobbiamo allinearle.

Ad esempio, abbiamo le seguenti due stringhe:

1. LA CASA È NUOVA
2. LA CASSA È VUOTA

E vogliamo confrontarle. Per farlo, procediamo con il loro allineamento. Cioè le disponiamo come di seguito:

LA CAS-A È NUOVA
LA CASSA È VUOTA

Se si dispongono le stringhe in questo modo, su due righe, le loro differenze divengono evidenti e quindi si riescono a elencare le operazioni in grado di trasformare, ad esempio, una stringa nell’altra. Per esempio, per trasformare la frase 1 nella frase 2, dovremmo inserire una “S” nella stringa 1; cambiare una “N” in “V” e una “V” in “T”.

Esistono, però, vie alternative attraverso cui si può trasformare la stringa 1 nella stringa 2. Per esempio:

LA CAS-A È N-UOV-A
LA CASSA È -VUO-TA

In questo caso, per trasformare la stringa 1 nella stringa 2, bisogna aggiungere una “S”; rimuovere una “N” e aggiungere una “V”; rimuovere una “V” e aggiungere una “T”. Rispetto a prima, il numero di operazioni da fare è maggiore. Tra tutti i possibili allineamenti, quindi, si sceglie quello che prevede il numero minore di operazioni. La lunghezza minima della sequenza di operazioni misura la distanza tra la stringa 1 e la stringa 2. Se le due stringhe fossero due sequenze aminoacidiche o nucleotidiche, queste considerazioni rimarrebbero le stesse se non per il fatto che ciascun simbolo questa volta rappresenta un’entità chimica: un aminoacido o una base nucleotidica.

Quando effettuiamo un allineamento potrebbe verificarsi che: i simboli delle due sequenze coincidano in uno o più punti; che i simboli delle due sequenze siano diversi in uno o più punti; che uno o più simboli siano presenti in una sequenza ma non nell’altra. Nel primo caso i residui aminoacidici o i nucleotidi in quella posizione sono rimasti invariati, cioè conservati durante l’evoluzione. L’identità di residui appaiati è chiamata match. Nel secondo caso, durante l’evoluzione, un residuo è stato sostituito da un altro, e si parla di mismatch. Nel terzo caso, per poter ottimizzare la corrispondenza tra gli aminoacidi o i nucleotidi delle due sequenze si è dovuto inserire una interruzione (gap) in una sequenza piuttosto che nell’altra. Durante l’evoluzione, in quelle posizioni, uno o più residui sono andati persi in una sequenza oppure è successo che nell’altra si sono aggiunti uno o più residui.

L’allineamento riassume la storia evolutiva delle due sequenze e indica le zone più conservate e quelle più variabili. Quando si analizzano sequenze biologiche che possono essere lunghe anche diverse centinaia di simboli, il semplice confronto manuale non è più praticabile e si deve ricorrere necessariamente a sistemi automatici.

Se le sequenze di due proteine o di DNA sono molto simili allora lo saranno anche le loro strutture e le funzioni. Non è però vero il contrario. Infatti, proteine con funzione e struttura simili non hanno necessariamente sequenze simili. Siccome stiamo trattando sequenze biologiche, il problema può essere approcciato utilizzando due diversi punti di vista, che di fatto conducono allo stesso risultato. Si dice infatti che, per capire se si tratta di geni omologhi ad esempio, si cerca:

• Minima distanza tra le due sequenze;
• Massima similarità tra le due sequenze.

Nel primo caso si fa riferimento al processo evolutivo. Nel secondo caso, si fa riferimento più direttamente alla ricerca di zone simili, per poterne derivare delle relazioni strutturali e funzionali.

Come calcolare la distanza tra due sequenze

Al fine di classificare i geni omologhi appartenenti a una stessa famiglia è fondamentale la costruzione di un albero filogenetico che ne descriva in modo accurato le relazioni evolutive. Per fare questo, alcuni metodi richiedono la misura delle distanze evolutive tra i geni in esame.

Di Levenshtein: algoritmo edit distance

La distanza di Levenshtein è una misura per la differenza fra due stringhe. La distanza di Levenshtein tra due stringhe A e B è il numero minimo di modifiche elementari che consentono di trasformare la A nella B. Per modifica elementare si intende:

• La cancellazione di un carattere;
• La sostituzione di un carattere con un altro;
• L’inserimento di un carattere.

Per esempio, per trasformare la parola “bar” in “biro” occorrono due modifiche:

1. “bar” -> “bir” (sostituzione di ‘a’ con ‘i’)
2. “bir” -> “biro” (inserimento di ‘o’)

Non è possibile trasformare la prima parola nella seconda con meno di due modifiche, quindi la distanza di Levenshtein fra “bar” e “biro” è 2.

Vediamo quest’altro esempio:

Specie A: A W T V A S A V R T S I Y A
Specie B: A T V A A V R T S I A L Y
Specie C: A T V A A V T S I

L’edit-distance è adatta nel caso degli allineamenti globali. Per l’edit distance deve valere la disuguaglianza triangolare. Se ho x, y e z e l’evento di mutazione da x a y ha un costo > dell’evento di mutazione x->z + z->y allora ogni volta che devo sostituire x con y devo effettuare due sostituzioni prima con z e poi con y perché al fine del punteggio finale “costano” meno. L’edit distance, infatti, prevede che si devono minimizzare i costi di eventi di mutazioni per passare da una sequenza all’altra. Prevale il concetto che l’evoluzione deve “risparmiare”. Quindi, facendo riferimento all’esempio, da A si passa a B per mezzo di 2 mutazioni e da B si passa a C per mezzo di 1 mutazione. Quindi sommando 2 mutazioni + 1 mutazione otteniamo tre mutazioni che si sono susseguite nel corso dell’evoluzione per passare dalla sequenza A a quella C.