2. Il sangue

Il sangue

5 litri circa (= 85ml/Kg di peso corporeo); 1gc = 50 µl. Il sangue è un tessuto connettivo costituito da una porzione liquida, il plasma, nella quale sono sospesi gli elementi corpuscolati del sangue. Il plasma è costituito per il 90% di H₂O e per il 10% da soluti; tra questi vi sono: proteine, lipidi, aas (alanina e glutammina), glucosio e sali.

Elementi corpuscolati del sangue

La parte corpuscolata è costituita prevalentemente da eritrociti, seguono leucociti e piastrine. Tra i leucociti abbiamo: granulociti polimorfonucleati (neutrofili, eosinofili e basofili), linfociti e monociti (definiti nel complesso agranulociti mononucleati). Il siero differisce dal plasma per la mancanza di fattori della coagulazione, fondamentalmente del fibrinogeno.

Per separare il plasma dagli elementi corpuscolati è sufficiente addizionare anticoagulante, centrifugare e lasciare sedimentare. Nella provetta si formano tre distinti strati: plasma nel surnatante, eritrociti nel precipitato ed un sottile strato intermedio contenente leucociti e piastrine. Il plasma ha un colore giallastro per la presenza di fibrinogeno.

Il plasma costituisce il 55-59% del volume ematico. Gli elementi corpuscolati costituiscono il 41-45% del volume ematico. La percentuale del volume ematico occupata dalle emazie è definita ematocrito e corrisponde al precipitato della provetta (generalmente più elevato nel sesso maschile).

Procedura per ottenere il siero

Per ottenere il siero è necessario centrifugare in assenza di anticoagulante in modo che il fibrinogeno precipiti in maglie di fibrina. In questo caso si ottengono due soli strati (siero + eritrociti).

Gli anticoagulanti maggiormente utilizzati sono:

• EDTA e Citrato, hanno gruppi carichi negativamente che consentono di chelare il calcio.
• Eparina, potenzia l'attività dell'antitrombina 3 (sistema antitetico alla trombina che consente la conversione fibrinogeno —> fibrina).

Funzioni del sangue

Il sangue svolge diverse funzioni fondamentali:

• Trasporta dei gas respiratori.
• Veicola le sostanze assorbite dall'intestino ai tessuti.
• Veicola i cataboliti dai tessuti agli organi emuntori (pelle, reni, polmoni, intestino).
• Veicola gli ormoni dalla sede di produzione agli organi bersaglio.
• Regola la distribuzione di calore nell'organismo.
• Regola il pH e la composizione dei liquidi interstiziali (importante ruolo dell'albumina, principale responsabile della pressione oncotica che richiama acqua dagli spazi interstiziali).
• Protegge da tossine e patogeni per la presenza di cellule ed elementi del sistema immunitario.

Il plasma e le proteine plasmatiche

Il plasma partecipa alle seguenti funzioni: mantenimento dell'osmolarità (fisiologica 300 mOsm) e della pressione oncotica, trasporto di ormoni, lipidi, vitamine, ioni metallici, funzione immunitaria, processi di coagulazione. Il plasma contiene un centinaio di proteine (tutte globulari!), distinte in due gruppi: globuline e albumine. Le globuline sono più semplici e di dimensioni minori. Le albumine sono più complesse ed in genere legate ad altre proteine, a porzioni glucidiche, a metalli, a lipidi (glicoproteine, metalloproteine, lipoproteine).

Le proteine plasmatiche hanno un'emivita media di circa 10 giorni quindi un rapido turn-over; ciò implica un'elevata velocità di degradazione. La degradazione avviene mediante endocitosi cellulare ed idrolisi della parte proteica, i coniugati glucidici o lipidici vengono rimossi ad opera di glicosidasi e/o specifiche idrolasi e tutti i componenti seguono vie di riciclo. Con l'eccezione delle Ig e degli ormoni proteici, la maggior parte delle proteine plasmatiche viene sintetizzata dal fegato.

Una soluzione si dice fisiologica se ha la stessa osmolarità del sangue. L'acqua è una soluzione fortemente ipotonica (Osm = 0), per ottenere una soluzione fisiologica devo aggiungere 0,9g NaCl/100ml di H₂O (quindi 0,9% di sali).

Le proteine plasmatiche possono essere separate mediante elettroforesi su gel d'agarosio. L'elettroforesi viene solitamente effettuata sul siero per evitare che il fibrinogeno interferisca con l'analisi. L'elettroforesi si effettua a pH 8.6. Tutte le proteine plasmatiche possiedono infatti un punto isoelettrico <8.6 per cui a questo valore si comporteranno da acidi, rilasciando in soluzione ioni H⁺ ed acquisendo carica negativa. In questo modo le proteine (tutte cariche negativamente) migreranno verso il catodo con una velocità che sarà in funzione del loro P.M e della quantità di cariche negative. Nel gel elettroforetico si ottiene una serie di bande che corrispondono ai picchi del tracciato.

La migrazione più veloce è quella della pre-albumina seguita dall’albumina (piccole e più cariche). Seguono le globuline (IgA, IgG, IgM ecc).

Profilo elettroforetico e varianti genetiche

Di seguito è riportato un esempio di profilo elettroforetico di una variante genetica dell'albumina (sx). A dx, il picco alto e stretto sta ad indicare un eccesso patologico di Ig monoclonali che potrebbe essere dovuto ad un tumore delle plasmacellule. Nelle patologie epatiche, ad esempio nella cirrosi epatica, avremmo una riduzione del picco dell'albumina. P.I = Valore di pH al quale la proteina ha carica netta uguale a zero. Ricorda che le proteine sono molecole anfotere, possono comportarsi da acidi o da basi a seconda del pH della soluzione in cui si trovano.

Funzioni della prealbumina e dell'albumina

1. Prealbumina - Proteina di trasporto della tiroxina (ormoni tiroidei).

2. Albumina - È la più abbondante proteina del plasma (50% del totale). È una proteina semplice formata da un'unica catena polipeptidica di PM 66-69 kDa, contenente 5-6 tasche idrofobiche. Viene sintetizzata dal fegato nella forma di pre-albumina che diventa albumina mediante il distacco di un peptide segnale N-terminale a livello del RER cui segue un secondo distacco di un esapeptide all’estremo N-terminale, lungo la via secretoria verso il sangue. L'emivita dell'albumina è di circa 20 giorni.

Funzioni:

• Grazie all’elevata concentrazione ed all’abbondante presenza di cariche negative (17 cariche per molecola a pH 7.4) è la principale responsabile della pressione oncotica del sangue e quindi del riassorbimento di acqua nei capillari venosi. Questa proprietà ha un ruolo fondamentale nel controllo degli scambi idrici fra capillari e liquido interstiziale: se la concentrazione di albumina nel plasma diminuisce si possono formare edemi per un’insufficiente richiamo di acqua dallo spazio interstiziale. Una riduzione di albumina può essere causata da un’insufficiente sintesi epatica, come si verifica in caso di cirrosi epatica o nella malnutrizione proteica (Kwashiorkor) o per un’eccessiva eliminazione con le urine come nel caso delle glomerulonefriti (alterazione del filtro glomerulare).
• L’albumina è una proteina di trasporto. Grazie all’abbondanza di cariche negative superficiali, può legare reversibilmente cationi Ca²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺. La presenza di tasche idrofobiche le consente di trasportare molecole idrofobiche come acidi grassi liberi, bilirubina ed alcuni farmaci (penicillina, sulfamidici, salicilati etc.). L’albumina inoltre riesce a veicolare anche ormoni sessuali e steroidei come il cortisolo anche se con un’affinità più bassa rispetto alla transcortina.
• L'albumina funge anche da importante riserva proteica, infatti può essere endocitata dalle cellule nelle quali i suoi aas vengono degradati ed utilizzati per la sintesi proteica.

Globuline e proteine di trasporto

3. Globuline - Sono proteine coniugate (glico-/lipo-/metallo-proteine) con elevato PM che svolgono diverse funzioni: trasporto, reazione immunitaria, funzione enzimatica ed altre funzioni particolari.

Proteine di trasporto

• RBP, Retinol Binding Protein che lega la vit.A.
• Gli acidi grassi liberi (FFA) vengono prodotti dal tessuto adiposo, a partire dai trigliceridi, in condizioni ipoglicemiche.
• La bilirubina indiretta (non solubile nel plasma) deriva dalla degradazione dell’eme, in particolare dell’anello pirrolico, operata a livello splenico. L’albumina la trasporta al fegato dove viene coniugata con l’acido glucoronico che rende la molecola solubile ed eliminabile in forma di urobilina e stercobilina.
• CBP, Cortisol Binding Protein o transcortina.
• SHBG, Sexual Hormones Binding Protein.
• Vitamina D binding globulin.
• Transcobalamina che lega la vit.B12.
• Transferrina, glicoproteina sintetizzata dal fegato il cui compito è quello di trasportare il ferro (nella sua forma ossidata Fe³⁺) introdotto con la dieta e che si libera dalla degradazione degli eritrociti nella milza, verso le sedi di utilizzo quali fegato (dove verrà utilizzato ad esempio per la formazione dei citocromi) e midollo osseo (per l’emopoiesi).
• Ceruloplasmina, globulina contenente 8 siti di legame per il rame (Cu²⁺), catalizza la reazione redox in cui il Fe²⁺ si ossida in Fe³⁺ che si va a legare alla transferrina, contemporaneamente il rame si riduce da Cu²⁺ a Cu⁺.
• Aptoglobine, legano i dimeri alpha-beta dell’ossiemoglobina che possono ritrovarsi nel plasma in seguito ad eventi emolitici intravasali. In condizioni fisiologiche una bassissima percentuale degli eritrociti in circolo può andare incontro a lisi. Gli eritrociti lisati riversano l’emoglobina in circolo che verrebbe persa, insieme al ferro, a livello renale; per evitare ciò, le aptoglobine si legano ai dimeri alpha-beta. Il complesso aptoglobina-emoglobina è troppo grande per passare nell’ultrafiltrato renale e viene rimosso dai macrofagi che recuperano il ferro e la componente proteica dei dimeri.
• Emopexina - Lega l’eme dell’emoglobina. Se siamo in presenza di un’elevata lisi degli eritrociti o in carenza di aptoglobina, i dimeri alpha-beta si aprono e la globina si stacca dal gruppo eme che si va a legare all’emopexina in modo che il ferro sia recuperato e non perso.
• Lipoproteine - Aggregati micellari lipoproteici deputati al trasporto ematico di trigliceridi, colesterolo esterificato e non esterificato. La componente proteica è costituita da apolipoproteine legate in maniera non covalente alla componente lipidica; l’assenza di legami covalenti permette lo scambio dei costituenti tra le lipoproteine e le membrane cellulari. Le lipoproteine plasmatiche si differenziano per dimensioni, densità e composizione sia lipidica che proteica. Densità e dimensioni dipendono dal rapporto quantitativo proteine/lipidi: la densità aumenta e le dimensioni diminuiscono all’aumentare della componente proteica rispetto alla lipidica. Le lipoproteine plasmatiche hanno forma globulare nella quale apolipoproteine, teste dei fosfolipidi e colesterolo formano l’involucro esterno entro il quale sono racchiusi i lipidi idrofobici (trigliceridi e colesterolo esterificato).

Classi di lipoproteine

Le lipoproteine plasmatiche sono riconducibili alle seguenti classi:

• Chilomicroni, sono le lipoproteine più leggere e trasportano i lipidi (trigliceridi) assunti con la dieta dall’intestino, dapprima al sistema linfatico poi con il sangue raggiungono il muscolo ed il tessuto adiposo. Nei capillari di questi tessuti la lipoproteina-lipasi (attivata da ApoC-II) idrolizza i trigliceridi a glicerolo + acidi grassi che entrano nei tessuti. Nel tessuto adiposo i trigliceridi vengono riesterificati mentre nel muscolo sono ossidati per ricavarne energia.
• VLDL, very low density lipoprotein, trasportano per lo più i trigliceridi di origine epatica al tessuto adiposo. Sono prodotte dal fegato. In seguito ad un pasto ricco di carboidrati si accumula citrato nei mitocondri ed il ciclo di Krebs rallenta (la cellula sta bene energeticamente); il citrato esce nel citosol dove è presente una citrato-liasi ATP-dip, stimolata dall’insulina, che scinde il citrato in ossalacetato + acetil-CoA. L’acetil-CoA viene utilizzato dall’AcetilCoA carbossilasi per formare il Malonil-CoA per la sintesi degli acidi grassi. Gli acidi grassi formati andranno a costituire insieme alle proteine le VLDL che verranno inviate al tessuto adiposo. Mano a mano che le VLDL rilasciano acidi grassi, si arricchiscono di colesterolo e si ‘trasformano’ in LDL (colesterolo cattivo).
• IDL, intermediate density lipoprotein, sono ciò che resta delle VLDL mature dopo che queste hanno rilasciato i trigliceridi.
• LDL, low density lipoprotein, IDL che si sono arricchite di colesterolo e di Apo B-100; vengono sintetizzate anche direttamente dal fegato con la funzione di trasportare colesterolo ai tessuti extraepatici. I recettori per le LDL sono presenti nel tessuto muscolare, nel rene, nei linfociti ecc. Il colesterolo è utilizzato da questi tessuti per la sintesi di membrane ed ormoni steroidei. Sono coinvolte nella formazione delle placche aterosclerotiche.
• HDL, high density lipoprotein, si formano nel fegato e nell’intestino ed hanno la funzione di captare il colesterolo libero rilasciato durante il turn-over tissutale e di riportarlo al fegato.

Proteine coinvolte nella funzione immunitaria

Immunoglobuline - Prodotte dai linfociti B in seguito a stimolazione da parte di specifici antigeni. Gli anticorpi si legano a specifici epitopi (o determinanti antigenici) rendendo l’antigene più facilmente riconoscibile ed eliminabile da parte dei macrofagi. Le Ig sono costituite da due catene polipeptidiche ‘leggere’ o L e da due catene ‘pesanti’ o H. Le due catene H sono tenute insieme da due legami disolfuro intercatena e ciascuna catena H ancorata ad una catena L con un ponte disolfuro. Ciascuna catena H ed L a sua volta tenuta ripiegata da una serie di legami disolfuro intracatena. Le regioni N-terminali delle catene H ed L sono le regioni variabili e costituiscono il cosiddetto frammento FAB, deputato al riconoscimento e legame con il determinante antigenico. Le regioni C-terminali delle catene H ed L sono le regioni costanti e costituiscono il frammento Fc. La zona delle catene H a livello della quale sono presenti i legami S-S intermolecolari detta regione cerniera ed a questo livello sono presenti legami carbamidici sensibili al trattamento con pepsina e papaina.

Classi di Ig presenti nel sangue:

• IgG, più abbondanti, forma monomerica, attraversano facilmente i capillari ed anche la placenta, formazione lenta (10gg circa).
• IgM, immunoglobuline di dimensione maggiore, pentameri con monomeri uniti da ponti S-S tra catene pesanti di subunità contigue + catena J supplementare al centro, rapida risposta all’Ag (2-3gg).
• IgA, dimeri, presenti nel siero e nelle secrezioni.
• IgD, funzione non definita.
• IgE, si legano ai basofili ed ai mastociti sensibilizzandoli agli allergeni.

Sistema del complemento - Costituito da una ventina di proteine che si attivano mediante proteolisi con un meccanismo a cascata. Il complesso finale che si forma si attacca alla membrana batterica determinando la formazione di un poro con conseguente lisi della cellula e liberazione di peptidi che promuovono la chemiotassi e la fagocitosi. Il sistema del complemento interagisce anche con i complessi Ag-Ab determinandone la frammentazione proteolitica e la conseguente rimozione.

Proteine con funzione enzimatica

• Enzimi che esercitano la loro funzione nel sangue, sintetizzati in altri organi e secreti nel sangue in forma di pro-enzimi inattivi che vengono attivati in particolari condizioni, oppure di enzimi attivi come la renina.
• Enzimi della coagulazione.
• Enzimi della fibrinolisi (plasmina).
• Enzimi della regolazione della pressione (sistema renina-angiotestina).
• Enzimi secreti da ghiandole esocrine (pancreas, prostata, mucosa gastrica ed intestinale, ghiandole lacrimali) di solito presenti in tracce.
• Enzimi tissutali, possono essere enzimi normalmente secreti nel sangue (come la colinesterasi epatica) o riversati in circolo in seguito a necrosi, in questo caso questi enzimi fungono da marker di danni tissutali.

Patologie correlate agli enzimi:

• Pancreatite: amilasi e lipasi.
• Patologie ossee: fosfatasi alcaline.
• Carcinoma della prostata: fosfatasi acida.
• Patologie muscolari: cheratin-kinasi (CK).
• Epatopatie: ALT e AST (aspartato-aminotransferasi e alanina-aminotransferasi).
• Infarto miocardico: Troponina I (da 3-4 post IM fino a settimane), LDH (lattato deidrogenasi), AST, CK, Mioglobina.

Proteine con funzioni particolari

• Proteine ormonali - Fetoproteina, simile all’albumina e contenuta in alta concentrazione nel plasma fetale; la sua concentrazione diminuisce drasticamente alla nascita. Il suo dosaggio è importante per la diagnosi di spina bifida ed altre malformazioni della colonna vertebrale del feto (dovuto a fuoriuscite di fetoproteina nel liquido amniotico). Nell’adulto un suo aumento si riscontra nell’epatocarcinoma primario.
• Alpha-1-antitripsina, proteina di fase acuta con attività anti-proteasica; è prodotta dal fegato e dai macrofagi con la funzione di inibire le serina-proteasi quali elastasi e tripsina (rilasciate dai neutrofili attivati) che danneggerebbero i tessuti.
• Marcatori tumorali, CEA etc.
• Proteina C reattiva (PCR), prodotta dal fegato in seguito a stimolazione da parte dell’IL-6; funge da opsonina stimolando la fagocitosi e facilitando l’azione del sistema del complemento. Piccole variazioni di PCR si verificano anche in caso di infezioni.