16) Lezione Citochinine

Lezione 16. Gibberelline-citochinine

Introduzione alla segnalazione delle gibberelline

Ieri abbiamo visto che su alcuni mutanti di riso, è stato identificato il recettore delle gibberelline, GID1. Si è capito che questo recettore è il recettore delle gibberelline, in quanto era presente nell’endosperma amilaceo dei semi.

Abbiamo visto anche, che la via di segnalazione delle gibberelline è stata studiata sui semi, i quali sono formati da un embrione e da un endosperma. Se vengono separati, l’endosperma non attiva più la degradazione dell’amido. Invece se l’embrione e l’endosperma venivano rimessi insieme, c’era la degradazione dell’amido. Mentre se all’endosperma veniva data gibberellina, e si trovava lontano dall’embrione, l’endosperma attiva la degradazione dell’amido.

Quindi, questo ha fatto capire ai ricercatori che nell’embrione ci fosse una sostanza diffusibile, capace di attivare la degradazione dell’amido, e questa sostanza diffusibile è data dalle gibberelline. Quindi nell’embrione ci sono le gibberelline.

Che cosa succede? Che la via di trasduzione del segnale, una volta che l’ormone si lega al recettore, si attiva un recettore delle proteine G. Questo recettore delle proteine G, a sua volta, attiva una risposta. Quindi per avere una via di segnalazione da parte delle gibberelline, c’è bisogno che le gibberelline si leghino al recettore, e questo legame gibberelline-recettore, porta all’attivazione delle proteine G, che una volta attivate, attivano la via di segnalazione.

Geni responsabili della risposta alle gibberelline

Quando studiate le gibberelline, siccome sul libro è molto complesso, cercate i paragrafi che vi parlano di alcune cose. In Arabidopsis sono stati identificati alcuni geni responsabili della risposta alle gibberelline. Questi 5 geni sono stati chiamati, e sono:

• GAI, che è GIBBERELLINA-INSENSIBILE.
• RGA, che è REPRESSOR di GA.
• RGL1
• RGA2
• RGL3

Quindi in Arabidopsis sono stati identificati 5 geni DELLA, che non rispondono alle gibberelline. Infatti, GAI è insensibile alle gibberelline.

Ruolo delle DELLA-protein e GRAS

Le DELLA-protein sono una sottoclasse della famiglia GRAS, che sono dei regolatori di trascrizione, quindi le GRAS regolano la trascrizione dei geni. La cosa interessante è che GRAS è un regolatore negativo della trascrizione. Le DELLA-protein fanno parte del dominio delle GRAS, in quanto sono i regolatori del dominio delle GRAS, che sono repressori. DELLA-protein regolano il dominio delle GRAS, ed il dominio GRAS è un dominio repressore.

Quindi GRAS regolano la trascrizione delle gibberelline in maniera negativa, e sono quindi dei regolatori negativi della via di trascrizione delle gibberelline, in quanto DELLA regola il dominio di trascrizione delle GRAS. È importante capire il ruolo di DELLA-protein, in quanto su questo agisce anche un altro ormone, l’acido abscissico, il quale attiva la dormienza dei semi.

Degradazione dei repressori GRAS

Qual è la via di degradazione dei repressori GRAS, regolata dalle gibberelline? Sono stati identificati dei geni ortologhi, GID2 e SLY1 (slai 1). Questi geni sono estremamente importanti perché codificano per delle proteine F-box, che sono componenti dei complessi E3-ubiquitina ligasi.

A che cosa serve l’ubiquitina ligasi? L’ubiquitina ligasi segnala la proteina alla via di degradazione del proteasoma. Quindi se c’è un legame con l’ubiquitina ligasi, significa che la proteina deve essere ubiquitinata, e successivamente può andare verso la via di degradazione, al proteasoma 26s. Questi geni ortologhi sono importantissimi perché hanno il legame con l’ubiquitina ligasi, e quindi mandano le proteine verso la via di degradazione.

Qual è la via di degradazione dei repressori GRAS? Se la gibberellina è repressa da GRAS, significa che GRAS fa in modo che non si attivi la via di trasduzione del segnale, mediata dalle gibberelline. Se sono attivi i GRAS, ma se sono attive soprattutto le DELLA-protein, che regolano il dominio di GRAS, queste sono repressori trascrizionali, le piante non rispondono alle gibberelline.

Affinché le gibberelline possano attivare la loro funzione, c’è bisogno che il repressore venga degradato, allontanato, per far sì che il repressore non attivi più la repressione dei geni di trascrizione, mediato dalle gibberelline. Per fare questo c’è bisogno che il dominio GRAS, e soprattutto le DELLA-protein, che sono i regolatori dei GRAS, siano allontanati dalla via di trasduzione delle gibberelline, e che quindi siano portate verso la via di degradazione del proteasoma.

Io per aprire la porta, posso andare verso la porta ed aprirla, ma se davanti a me c’è un muro, alla porta io non ci arrivo, e quindi le gibberelline non ci arrivano, perché il muro blocca la mia andata verso la porta. Se rompo questo muro, sono libera di andare ad aprire la porta. Quindi GRAS, in qualche modo, bloccano l’azione delle gibberelline, ed affinché le gibberelline possano agire, c’è bisogno che GRAS venga degradato, attraverso la via del proteasoma.

Processo di ubiquitinazione

Repressore → Non attiva la via di trascrizione. Per attivare la via di trascrizione → Bisogna allontanare il repressore trascrizionale → Attraverso la via del proteasoma → Che a monte porta l’ubiquitina della proteina. La proteina quando viene ubiquitinata → Va verso la via di degradazione.

GID2, in riso, segnala per la via di degradazione del repressore GRAS, SLR1. Questo fa capire che GID2, in riso, riconosce GRAS, ma solo se GRAS è legato a dei geni ortologhi, come SLR1, ma anche GID2 e SLY1. Quindi se GRAS è legato a questi geni ortologhi, a loro volta questi geni attivano l’ubiquitinizzazione della proteina, ed attivano il complesso per la degradazione.

SLY1, in Arabidopsis, segnala per la via di degradazione del repressore GRAS, RGA e GAI. Questo è in riso, dove abbiamo che GRAS deve essere allontanato, in quanto è un repressore di trascrizione delle gibberelline. Per far sì che GRAS possa essere allontanato, ci deve essere il complesso SCF, un complesso che attiva l’ubiquitinizzazione della proteina, e questo complesso è come una chaperon, in quanto accompagna la proteina verso il complesso di degradazione. Quindi per la degradazione del repressore, ci deve essere il complesso SCF, che, dove c’è stata l’ubiquitinizzazione della proteina, accompagna il repressore verso la via di degradazione.

Le DELLA bloccano l’attivazione delle gibberelline. Nell’immagine ho messo che bloccano la germinazione (Growth). Le DELLA bloccando la germinazione, le gibberelline non sono attive, e per far in modo che le gibberelline siano attive, e quindi per attivare la germinazione del seme, c’è bisogno che le DELLA-protein vengano distrutte, degradate.

La degradazione di DELLA-protein, e quindi del repressore GRAS, avviene grazie all’aggiunta delle gibberelline. Le gibberelline attivano una serie di complessi, soprattutto il complesso SCF, che portano all’ubiquitinizzazione di DELLA-protein, che vanno verso la via del proteasoma, ossia la via di degradazione, di distruzione.

Bersaglio delle gibberelline

Qual è il bersaglio delle gibberelline? Le gibberelline per attivare la via di segnalazione, hanno bisogno di un bersaglio. Per attivare la via di trascrizione, qual è il bersaglio delle gibberelline? Il repressore GRAS, che è regolato da DELLA-protein. Quindi per far in modo che ci sia l’attivazione della via di trascrizione, bisogna far in modo che non ci siano le DELLA-proteins, in quanto sono le DELLA che bloccano.

Poi vedremo che sono le DELLA che mantengono la dormienza del seme, e quindi se ci sono le DELLA, la dormienza del seme è sempre mantenuta alta, per cui bisogna fare in modo che le DELLA vengano degradate. Le DELLA sono i regolatori di GRAS, che sono repressori. Quindi per attivare una via di segnalazione, c’è bisogno che questa via sia libera, e questa via non è libera se ci sono dei repressori della trascrizione, GRAS, i quali a loro volta sono regolati da un dominio regolatore estremamente importante, DELLA-protein. DELLA è quello che regola GRAS, repressore. Quindi per far in modo che GRAS non sia repressore, bisogna eliminare le DELLA-protein.

Come faccio ad eliminare le DELLA-protein? Bisogna inviarle verso il complesso della degradazione. Quindi questa proteina DELLA deve essere degradata, ed una volta che questo complesso non c’è più, la gibberellina può attivare la via di trascrizione, perché non c’è nessuno che blocca la via di trascrizione. Quindi le gibberelline hanno come bersaglio DELLA-protein.

Attivazione della via di segnalazione

Che cosa devono fare le gibberelline per avere la via di segnalazione? Le gibberelline per avere la via di segnalazione, devono legarsi al recettore. Le gibberelline per attivare anche la via di degradazione, hanno bisogno che queste vengano riconosciute dal recettore. Una volta che si legano al recettore, il complesso gibberelline-recettore attivano la via di segnalazione delle gibberelline, che comporta la degradazione di DELLA-protein.

Abbiamo GID1, che è il recettore per le gibberelline, legano le gibberelline. Una volta che le gibberelline, in presenza di H₂O, si legano al recettore, GID1 subisce un cambiamento conformazionale, cioè cambia completamente il suo N-terminale. Che cosa fa? Non appena il recettore si lega alla gibberellina, questo legame cambia la sua conformazione, ed il suo N-terminale chiude, in qualche modo, il recettore GID1, all’interno del quale blocca le gibberelline.

Questo è estremamente importante perché, il cambio conformazionale di GID1, fa in modo che il suo N-terminale sia riconosciuto dalle DELLA-protein, in quanto, non appena c’è questo cambio conformazionale sull’ N-terminale di GID1, le DELLA-protein riconoscono l’ N-terminale, e si attaccano, grazie al loro N-terminale (di DELLA-protein), al recettore GID1 che ha cambiato conformazione. Quindi GID1 che ha attaccato gibberellina, con il suo N-terminale viene riconosciuto, e DELLA-protein riconosce questo cambio di conformazione, e si attacca al GID1 che ha attaccata con sé gibberellina.

Una volta che le DELLA-protein si sono attaccate al recettore GID1, questo recettore GID1, che a sua volta è associato ad una proteina F-box (GID2) che ha il complesso SCF, segnala la DELLA-protein verso la via di degradazione del proteasoma.

Riassunto del meccanismo di segnalazione

Ricapitolando. Abbiamo GID1, che è il recettore di gibberellina. Quando GID1 è esposto, è libero, la gibberellina si lega al suo recettore. La via di biosintesi delle gibberelline parte dall’ISOPENTENIL DIFOSFATO (IPP), si attiva la biosintesi, si formano le gibberelline che sono state attivate, e si legano al recettore. Il recettore una volta che si è legato alla gibberellina, cambia la sua conformazione, e la cosa importante è che cambia il suo N-terminale.

Non appena il recettore GID1 riceve gibberellina, il suo N-terminale racchiude all’interno di un’ansa, la gibberellina. Chiudendo il suo N-terminale sopra quest’ansa, si espone con il suo N-terminale verso l’esterno. Questo N-terminale cambiato è riconosciuto da DELLA-protein, e non appena le DELLA-protein vedono questo cambio di conformazione, a loro riconosciuto, si legano al recettore che ha con sé gibberellina. Il complesso del recettore GID1, a sua volta è legato alla proteina F-box, che è una proteina del complesso SCF, ossia un complesso che attiva l’ubiquitinizzazione di DELLA-protein, la quale viene portata verso il proteasoma, verso la degradazione.

Quindi non appena DELLA-protein si lega al recettore, questa viene presa ed accompagnata verso la via di degradazione, perché è stata riconosciuta dal recettore, ed a sua volta è stata riconosciuta dal complesso SCF. Questo è sempre lo stesso meccanismo. GID1 si lega alla gibberellina, si ha un cambio conformazionale. DELLA-protein, che è il regolatore di GRAS, si lega all’N-terminale del recettore, ed questo accompagna DELLA-protein verso la via di degradazione.

Quindi per attivare la via di segnalazione, c’è bisogno che DELLA-protein venga degradato. Perché DELLA-protein mantiene la via di segnalazione in negativo, delle gibberelline? Perché quando gibberellina non è presente, la conformazione di GID non cambia in GID1, ma questo cambia e si espone alle DELLA-protein che lo riconoscono.