10 Sintesi chimica del dna: generalita'; metodo del fosfodiestere; metodo del fosfotriestere; ; metodo del fosfito triestere; metodo del fosforoammidito + sintesi chimica dei geni

NUCLEOSIDE

Egli inoltre sperimentò diverse matrici polimeriche, ma non riuscì mai a risolvere il problema dello "swelling", ossia l'effetto di rigonfiamento che le matrici stesse presentano in alcuni solventi organici, tanto da essere definite con disprezzo polimeri "popcorn". Questo problema sarebbe stato risolto all'inizio degli anni '80 da Marvin Caruthers (suo collaboratore nonché ex studente), con l'introduzione della matrice solida "controlled pore glass" (CPG). Questa matrice è rappresentata da palline di silice.

Senza ombra di dubbio, il contributo più importante di Letsinger fu la revisione del metodo di sintesi proposto dal Prof. Khorana, dal quale scaturì il nuovo "METODO DEL FOSFOTRIESTERE" (Fig.13) basato, quindi, sulla sintesi in fase solida. Esso prevede la condensazione fra il nucleotide 5'-protetto-3'-fosfodiestereo (12), ed il nucleoside (13) direttamente.

Letsinger e collaboratori si adoperarono per sviluppare un più efficiente approccio di sintesi e nel 1976 definirono il METODO DEL "FOSFITO TRIESTERE". Il punto di forza di questa nuova strategia sintetica stava nella maggiore reattività dei fosfiti rispetto ai fosfati.

Al termine dell'accoppiamento tra l'OH al 5' del nucleoside legato al substrato e il fosfito al 3' del primo nucleotide, il fosfito stesso viene ossidato a fosfato triestere, stabilizzando il ponte fosfato.

Purtroppo anche questo approccio sintetico presentò da subito alcuni inconvenienti. L'approccio chimico del fosfito triestere venne eclissato nei primi anni '80 grazie all'introduzione del METODO DEL FOSFOROAMMIDITO. Caruthers si limitò semplicemente a sostituire il gruppo uscente cloruro nei nucleotidi di tipo 15, con un gruppo amminico (la Diisopopilammina) e diede così origine ai famosi reattivi fosforoammiditi di.

tipo 19. CH O3 NR 2 DIISOPROPILAMMINA

Questo reattivo dovrà reagire con il nucleoside associato al substrato solido CPG, che è una sfera di silice. Più precisamente, ciascuna biglia di silice è legata a una molecola distanziatrice, che a sua volta lega l'OH al 3' di un nucleoside che ha il 5' protetto da DMT. Nucleoside iniziale protetto al 5'

La prima reazione di questo metodo, quindi, consiste nella rimozione del gruppo protettore DMT dal 5' del nucleoside legato alla molecola distanziatrice. Questa reazione prende il nome di detritilazione e si realizza grazie all'aggiunta di acido dicloroacetico (TCA). Così facendo si viene a formare un OH al 5' del nucleoside.

Successivamente si effettua un lavaggio con l'acetonitrile per eliminare l'acido tricloroacetico in eccesso e poi laviamo con argon, così da rimuovere l'acetonitrile e rendere il tutto pronto per la fase successiva. Successivamente

viene attivato il reattivo fosforammidite con tetrazolo: si forma una carica positiva sull'azoto dal momento che acquista un idrogeno.

Quindi, avviene il legame tra l'OH al 5' del nucleoside legato al substrato e il fosforo al 3' del reattivo.

Fino a questo momento si è verificato un legame tra i due nucleotidi, ma non si tratta del legame fosfodiesterico che conosciamo noi in natura, ma è un triestere fosfitometilato. Il fosfito triestere risultante viene ossidato mediante una miscela di iodiofosfito a fosfato triestere.

A questo punto il ciclo può riprendere nuovamente fino a quando l'oligonucleotide desiderato è stato completato. Terminata la sintesi si allontanano chimicamente i gruppi OCH3 legati al fosforo, i filamenti si staccano dalla molecola di stanziatrice lasciando libera l'estremità 3'-OH, e infine si allontanano dalle basi i gruppi protettivi.

Si verifica ora la denitrilazione del DNA al 5' (per via chimica).

chimica questa volta) efosforilazione enzimatica, cosicché al 5' è ora presente il gruppo fosforico.