10 Sintesi chimica del dna: generalita'; metodo del fosfodiestere; metodo del fosfotriestere; ; metodo del fosfito triestere; metodo del fosforoammidito + sintesi chimica dei geni

Sintesi chimica del DNA

Con l’espressione “sintesi chimica del DNA” si fa riferimento alla produzione attraverso macchinari di corte sequenze nucleotidiche (dette, appunto, oligonucleotidi). In questo modo si possono, ad esempio, creare sonde che possono servire per l’ibridazione; si possono creare geni modificati da inserire in un vettore a creare molecole di DNA ricombinante che servono poi a creare animali transgenici; oppure si possono assemblare geni o loro frammenti; oppure si possono creare i primer per la PCR ecc.

A rendere la sintesi degli oligonucleotidi a singolo filamento un fatto ordinario è stata l’invenzione di macchine che rendono automatiche le reazioni coinvolte nella sintesi del DNA: si parla di sintetizzatori di DNA. Questo grosso macchinario viene messo sotto una cappa chimica, perché utilizza una serie di reagenti molto pericolosi. È dotato di un display dove bisogna scrivere la sequenza di oligonucleotidi che vogliamo che lo strumento sintetizzi. Di fianco ad esso ci sono 4 supporti in resina dove sono posti i nucleotidi (A, C, G, T) da aggiungere.

Storia della sintesi del DNA

Storicamente, la sintesi del primo dinucleotide risale al 1955 quando Michelson e Todd accoppiarono due unità di timidina opportunamente funzionalizzate e protette. A partire dagli anni ’50 un ricercatore di nome H. Gobin Khorana, si interessò della sintesi di oligonucleotidici ed introdusse alcuni concetti fondamentali che si rivelarono poi necessari per sintetizzare sequenze oligonucleotidiche con più di due unità monomeriche in successione.

Khorana prima di tutto intuì che il passaggio chiave della sintesi di oligonucleotidi consiste nella formazione sequenziale e specifica di legami internucleosidici 3’-5’-fosfodiesterei. In particolare, la biosintesi di acidi nucleici naturali avviene a partire da unità di nucleosidi 5’-trifosfato e procede in direzione 5’-3’, mentre la sintesi chimica di oligonucleotidi si realizza a partire da unità monomeriche di nucleosidi 3’-fosfato, al fine di sfruttare la maggiore reattività dell’ossidrile primario in 5’, rispetto a quello secondario in 3’, durante le reazioni di accoppiamento.

Struttura e reattività dei nucleotidi

Per capire quanto detto consideriamo la struttura di un normale nucleotide: Base azotata

Notiamo dalla struttura riportata sopra che il carbonio legato al gruppo OH è un carbonio secondario; mentre il carbonio legato al gruppo fosfato è un carbonio primario. Inoltre, sappiamo che il legame tra due nucleotidi si realizza tra l’ossigeno dell’OH al 3’ e il fosforo del gruppo fosfato al 5’:

Il carbonio al 3’, come detto, è un carbonio secondario e, quindi, l’OH risulta più ingombrato rispetto a quando è legato, ad esempio, a un carbonio primario e, di conseguenza, meno reattivo. Per questo motivo, per la sintesi chimica del DNA si preferiscono nucleotidi in cui l’OH è legato al carbonio 5’ e il gruppo fosfato al carbonio 3’. Quindi, mentre gli enzimi naturali sintetizzano DNA e RNA solo in una direzione da 5' a 3', la sintesi di oligonucleotidi chimici non ha questa limitazione, sebbene sia molto spesso eseguita nella direzione opposta, da 3' a 5'.

Controllo della regioselettività

Per poter ottenere un buon controllo della regioselettività delle reazioni di accoppiamento (cioè per far sì che realmente avvenga il legame fosfodiesterico, ad esempio, tra il gruppo fosfato al 3’ e il gruppo ossidrile al 5’), è necessario proteggere i principali centri nucleofili. In linea di principio è necessario utilizzare gruppi protettori adatti per le funzioni alcoliche dello zucchero (cioè i gruppi OH del ribosio) ed è necessario utilizzare gruppi pro...