10 EPIGENETICA

Modifiche istoniche e l'espressione genica

Analogamente al DNA, gli istoni possono essere modificati con l'aggiunta di gruppi chimici agli aminoacidi che li compongono. Alcune modifiche istoniche svolgono un ruolo molto importante nell'espressione genica e possono sia attivare sia reprimere la trascrizione impedendo, ad esempio, l'accessibilità del DNA all'RNA polimerasi o agendo come siti di ancoraggio per i fattori trascrizionali, proteine che possono facilitare o impedire l'attività della RNA polimerasi stessa. Inoltre, molte delle modifiche istoniche sono anche collegate allo stato di condensazione della cromatina, che naturalmente si ripercuote sull'attività trascrizionale. Una cromatina condensata, l'eterocromatina, è meno accessibile all'RNA polimerasi, mentre una cromatina rilassata, l'eucromatina, è più accessibile e, quindi, può essere trascritta più facilmente.

Tra le modifiche che gli istoni possono subire...

si annoverano l'acetilazione degli istoni, la metilazione degli istoni e la fosforilazione degli istoni. L'ACETILAZIONE DEGLI ISTONI è una modifica ampiamente associata con il rilassamento della cromatina, evento che favorisce l'accessibilità del DNA da parte dell'RNA polimerasi. L'acetilazione dell'istone H4 (contemporaneamente alla metilazione dell'istone H3) è una modifica che avviene anche all'inizio della riorganizzazione del DNA spermatico. Acetilazione di H4 e metilazione di H3 sono le principali modifiche epigenetiche che interessano gli spermatozoi. L'acetilazione, come la metilazione delle citosine, è mirata principalmente agli istoni che si trovano all'interno delle regioni promotori. Questo tipo di modifica è promossa da una classe di enzimi chiamate HATs (Istone acetil-transferasi) e prevede il trasferimento di un gruppo acetile (COCH3) dall'acetil-coenzima A all'azoto della

lisina in posizione 9 o in posizione 13 dell'istone H2A, o all'azoto della lisina in posizione 6 o in posizione 7 dell'istone H2B, oppure all'azoto della lisina in posizione 4 o 9 dell'istone H3. Di conseguenza, l'istone acetilato non sarà più in grado di legare in modo saldo l'elica del DNA carica negativamente dal momento che il gruppo acetile riduce la carica positiva degli istoni e ciò si riflette con una leggera decondensazione (o detta de-spiralizzazione della cromatina).

Negli spermatozoi i livelli di acetilazione su H3 e H4 sono alti nella fase delle cellule staminali e vengono completamente rimossi durante la meiosi. Questo processo è LA METILAZIONE DEGLI ISTONI è una reazione mediata dalla classe di enzimi istone metil-trasferasi e prevede il trasferimento di un gruppo metilico ad una lisina o un'arginina presente all'estremità N-terminale degli istoni H3 o H4. Il donatore dei gruppi metilici

è la S-adenosil-metionina (o SAM). Gli effetti dellametilazione degli istoni possono essere differenti. Un esempio è dato dalla metilazionedi K9-H3 (si legge: Lisina 9 sull'istone H3) che porta alla formazione di un sito dilegame per la proteina principale dell'eterocromatina (heterochromatin protein-1 o HP1), una proteina in grado di indurre impacchettamento e quindi ilsilenziamento. Viceversa una metilazione di K4-H3 ha l'effetto opposto e promuovel'apertura cromatinica con conseguente aumento dell'espressione genica.

LA FOSFORILAZIONE DEGLI ISTONI è una modifica che avviene alivello della regione N-terminale di tutti e quattro gli istoni (H2A, H2B, H3 e H4) ed èstata associata tradizionalmente alla formazione dei cromosomi metafasici. Avvienepiù frequentemente la fosforilazione della serina in posizione 10 dell’istone H3. Questafosforilazione, in realtà, può determinare sia la condensazione della

cromatina a formare i cromosomi con conseguente riduzione dell'intensità trascrizionale; ma al tempo stesso questa stessa modificazione può indurre attivazione della trascrizione. Questi due eventi contraddittori derivano dal fatto che se la serina in posizione 10 dell'istone H3 è fosforilata contemporaneamente alla serina in posizione 28 e alla timina in posizione 11 dello stesso istone si ha condensazione; se a essere fosforilata è la sola serina in posizione 10 dell'istone H3, viene favorita anche l'acetilazione dell'lisina in posizione 14 dello stesso istone, evento che favorisce la trascrizione. La fosforilazione degli istoni può essere anche un marker di danno al DNA soprattutto nel caso delle cellule uovo, dove il DNA è condensato sotto forma di cromatina e di tanto in tanto l'istone H2A è sostituito dall'analogo H2AX. Quando avviene una rottura, l'H2Ax più vicino a tale rottura

vienefosforilato richiamando enzimi che riparano il DNA. Un'altra modifica molto frequente che avviene post-traduzione e che interessa le lisine è la SUMOILAZIONE. La SUMOILAZIONE delle proteine (come, appunto, gli istoni) prende il nome di SUMOILAZIONE e consiste nell'aggiunta, covalente e reversibile, di piccole proteine simili all'ubiquitina, le SUMOs (Small Ubiquitin-like Modifier), a un residuo di lisina. Il legame di SUMO agli istoni sembra essere implicato nella repressione trascrizionale. La ChIP, acronimo di immunoprecipitazione della cromatina, è una tecnica che consente lo studio delle interazioni tra DNA e proteine al fine di identificare il sito di legame al DNA di un regolatore trascrizionale o di studiare la localizzazione lungo il genoma di una determinata modifica covalente a carico degli istoni, informazioni utili nell'ambito degli studi di epigenetica. Per prima cosa è necessario avere a disposizione il DNA sul quale condurre l'analisi. Il DNA può

essere estratto a partire da cellule in coltura. Tuttavia, è opportuno precisare che se iniziassimo il nostro saggio con la lisi delle cellule per estrarre il DNA, senza prima aver effettuato un trattamento con formaldeide, il nostro lavoro con alta probabilità potrebbe essere inutile. La formaldeide permette di evitare che in seguito alla lisi delle cellule, per estrarre il DNA, le proteine si stacchino dal DNA e l'interazione che volevamo studiare venga persa. Esistono altri agenti in grado di indurre la formazione di legami covalenti, ma si utilizza la formaldeide perché penetra molto velocemente attraverso le membrane biologiche e, oltre ad essere solubile in acqua, è attiva in diverse condizioni di salinità e di temperatura. Inoltre, l'esposizione a formaldeide deve essere controllata perché è un agente moderatamente denaturante per le proteine quindi, potrebbe interferire con il corretto folding e si potrebbero anche indurre

interazioni non volute andando amascherare le eventuali interazioni oggetto di studio. Per condurre le successive analisi, la cromatina viene sottoposta a trattamenti enzimatici (si parla di Nchip) o fisico-chimici come la sonicazione (si parla di Xchip), al fine di ottenere frammenti di cromatina. Questi frammenti di cromatina vengono incubati tutta la notte con anticorpi specifici in grado di riconoscere le modifiche chimiche a carico degli istoni o dei fattori di trascrizione. L'anticorpo e le proteine di interesse riconosciute formano un immunocomplesso. Per separare questa popolazione di frammenti da tutte le altre alle quali non siamo interessati, è necessario effettuare un trattamento in presenza di proteina A. La proteina A utilizzata sperimentalmente è di derivazione batterica, ma modificata in maniera tale da essere coniugata con delle sfere di sefarosio. La proteina Staphylococcus aureus viene prodotta come meccanismo di difesa nei confronti degli anticorpi.dei frammenti immuno-precipitati può essere effettuato utilizzando diverse tecniche. Ad esempio, è possibile eseguire una PCR per amplificare specifici segmenti di DNA legati all'anticorpo. In alternativa, si può utilizzare la tecnica di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per identificare tutti i frammenti di DNA legati all'anticorpo presenti nel campione. Queste tecniche consentono di studiare l'interazione tra l'anticorpo e la cromatina, fornendo informazioni sulle regioni genomiche coinvolte nella regolazione dell'espressione genica. La ChIP è quindi uno strumento fondamentale per comprendere i meccanismi molecolari che regolano l'attività dei geni.può proseguire con l'impiego di altre tecniche come ad esempio il microarray (si parla in questo caso di ChIP on chip), analisi proteica o sequenziamento del DNA (ChIP-seq). ChIP-Seq identifica i siti di legame delle proteine associate al DNA. Nella tecnica ChIP on chip, i frammenti di DNA ottenuti vengono marcati con fluorocromi rossi. Nel frattempo si frammenta e si marca con fluorocromi verdi il DNA di riferimento, cioè un DNA di controllo. Si allestisce un microarray dove sono presenti tanti pozzetti e in ciascuno di essi è presente un frammento di DNA corrispondente a un determinato gene. Nell'insieme i pozzetti rappresentano l'intero genoma di un individuo. Quindi si procede mescolando il DNA test con il DNA di riferimento e si procede all'ibridazione su microarray. Dopo aver incubato i due DNA su microarray, il tutto viene elaborato da un software. Se le modifiche istoniche del DNA in esame hanno portato, ad esempio, a una ridotta espressione di un gene, sarà possibile identificare tale riduzione attraverso l'analisi dei dati ottenuti dal microarray.

Il determinato gene, nel pozzetto relativo a questo gene si osserverà un colore verde (cioè quello del DNA reference); al contrario, se la modifica istonica del DNA test non avviene e il gene del DNA test è espresso maggiormente, nel pozzetto corrispondente a tale gene si osserverà il colore rosso (colore del DNA test); se le modifiche istoniche sono avvenute correttamente, il software mostra questa normale situazione con una colorazione gialla.

MEDIATA DAGLI RNAEPIGENESI

L'espressione genica può essere regolata anche da RNA come i miRNA e gli siRNA.

I microRNA (miRNA) sono piccole molecole endogene di RNA non codificante a singolo filamento. Si tratta di polimeri codificati dal DNA nucleare eucariotico lunghi circa 20-22 nucleotidi e principalmente attivi nella regolazione dell'espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale. I miRNA inducono il silenziamento genico tramite sovrapposizione con sequenze complementari presenti su

molecole di RNA messaggero (mRNA) bersaglio. Tale legame comporta una repressione della traduzione o la