10. Enzimi del plasma (fosfatasi alcalina e acida, transminasi, ldh, creatina chinasi, amilasi, ggt, colinesterasi, lipasi, oct, gpd, lisozima, ) e metodi di determinazione della loro quantita'

Enzimi del plasma

Fosfatasi alcalina (ALP)

Le fosfatasi sono un gruppo di isoenzimi, appartenente alla classe delle idrolasi, che catalizzano la scissione del legame estereo tra alcoli e acido fosforico. A seconda del pH si distinguono due gruppi di fosfatasi:

• Fosfatasi alcalina (o ALP), a pH compreso tra 8.6 e 10.3;
• Fosfatasi acida (o ACP), a pH compreso tra 4.8 e 6.

La fosfatasi alcalina è un enzima che si trova in diversi distretti del corpo, ma principalmente si localizza a livello osseo e a livello epatico. Nel fegato, la fosfatasi alcalina si trova nelle cellule che rivestono i dotti biliari, dove aiuta a digerire i grassi; la fosfatasi alcalina ossea è prodotta dagli osteoblasti, cellule deputate alla formazione dell'osso. Ogni tipo di tessuto produce forme diverse di fosfatasi alcalina, chiamate, appunto, isoenzimi. La fosfatasi alcalina epatica è indicata con la sigla ALP1; la fosfatasi alcalina ossea è indicata con ALP2. I bambini e gli adolescenti di solito hanno concentrazioni più alte di ALP in circolo perché le ossa sono ancora in crescita.

La fosfatasi alcalina epatica costituisce la principale frazione di ALP presente nel plasma di un adulto normale. In condizioni fisiologiche, la fosfatasi alcalina epatica tende a migrare, in una corsa elettroforetica, fino a disporsi all'altezza corrispondente alla frazione alpha-2 delle proteine plasmatiche. In condizioni anomale, come nel caso di cirrosi epatica, si presenta un'altra banda di fosfatasi alcalina in seguito a corsa elettroforetica. La fosfatasi alcalina epatica presente in condizioni normali è anche chiamata isoenzima epatico lento; mentre la fosfatasi alcalina epatica che compare in casi patologici e si dispone in una banda distinta da quella relativa all'isoenzima epatico lento su un substrato elettroforetico prende il nome di isoenzima epatico veloce.

Livelli di ALP

Livelli elevati di ALP sono associati a:

• Artrite reumatoide;
• Mancanza di calcio;
• Mancanza di vitamina D;
• Frattura ossea;
• Metastasi ossee;
• Osteosarcoma;
• Tumore al fegato;
• Tumore al pancreas;
• Cirrosi;
• Pancreatite;
• Mononucleosi;
• Colite ulcerosa;
• Linfoma di Hodgkin;
• Leucemia.

Livelli bassi di ALP possono essere conseguenti a:

• Trasfusione di sangue;
• Malnutrizione;
• Celiachia.

Metodo di dosaggio della fosfatasi alcalina

Uno dei metodi che permettono di dosare l'attività della fosfatasi alcalina (totale), e quindi la sua concentrazione, è il Metodo di Bessey-Lowry-Brock. Questo metodo prevede l'idrolisi di un substrato cromogenico, inizialmente incolore. In seguito all'idrolisi si forma un composto che diventa colorato (giallo) a pH basico. La reazione, nel caso del dosaggio dell'ALP, viene condotta a pH 10. Come substrato viene solitamente utilizzato il p-nitrofenilfosfato (anche detto paranitrofenilfosfato), il quale, in seguito a idrolisi catalizzata dalla fosfatasi alcalina in presenza di una molecola di acqua, dà vita al para-nitrofenolo e fosfato. Il para-nitrofenolo conferisce alla miscela di reazione una colorazione gialla che assorbe a 405 nm.

Quindi, come detto, dal capitolo precedente, si parte dalla considerazione secondo la quale l'attività enzimatica è espressa come:

1 U.I. = 1 microMole di substrato convertito/min. = C/min.

Dove C= concentrazione substrato.

Dalla legge di Lambert Beer:

Assorbanza= epsilon*l*C

si ricava che: C= Assorbanza/epsilon*l

Quindi:

1 U.I.= C/min= Assorbanza/epsilon*l*min

Ma bisogna tener conto anche del volume della miscela di reazione e del volume del campione iniziale. Quindi:

1 U.I.= Assorbanza*V*1000/ epsilon*l*min*v

Dove V= volume miscela di reazione (in ml); 1000= fattore di conversione da ml a milliunità internazionali; v=volume di campione iniziale.

Intervalli di riferimento

• Bambini fino a 1 anno: 160-1050 U/L
• Adulti: 70-270 U/L

Per conoscere la quantità della sola fosfatasi alcalina epatica o della sola fosfatasi alcalina ossea si può fare riferimento al frazionamento al calore. Cioè si riscalda il campione per 15 minuti a 56°C. La fosfatasi alcalina epatica risulta stabile al calore, mentre quella ossea risulta labile. Quindi, dopo riscaldamento, si può ripetere il metodo prima descritto e si conosce la quantità di fosfatasi alcalina epatica. Per conoscere la sola quantità di fosfatasi alcalina ossea, si effettua prima del riscaldamento il metodo prima descritto e si conosce la quantità totale di fosfatasi alcalina. Dopodiché si riscalda il campione per 15 minuti a 56°C e si ripete il metodo. Si ottiene così, come detto, la quantità di fosfatasi alcalina epatica. Si sottrae, poi, alla quantità totale di fosfatasi alcalina la quantità di fosfatasi alcalina epatica e si conosce il valore della fosfatasi alcalina ossea.

Fosfatasi acida

Al pari della fosfatasi alcalina, anch'essa catalizza l'idrolisi del legame esterico tra acido fosforico e alcoli. È un enzima ubiquitario: nell'uomo, se ne distinguono di solito una di origine eritrocitaria ed una prostatica (fosfatasi acida prostatica; PACP). In realtà, oltre a quella eritrocitaria e prostatica, si distinguono altre due isoforme di fosfatasi acida: una lisosomiale e una macrofagica. Tutte le forme di fosfatasi acida sono codificate da geni posti su cromosomi diversi. Le cellule della prostata contengono la più elevata concentrazione di fosfatasi acida. Differentemente dagli altri tessuti, dove svolge la sua azione nell'ambiente intracellulare, nella prostata, la PACP viene prodotta dalle cellule epiteliali prostatiche e viene riversata nel liquido seminale, mediante esocitosi, sotto lo stimolo del testosterone.

In condizioni normali, l'ACP presente nel plasma deriva dai globuli rossi e dalle piastrine. Tende ad aumentare in modo notevole conseguentemente a carcinoma prostatico metastatizzato (è, infatti, utilizzato come marcatore tumorale per il tumore alla prostata).

Dosaggio della fosfatasi acida prostatica

Per dosare la quantità di fosfatasi acida prostatica si procede utilizzando il metodo del diazo-accoppiamento. La prima reazione prevede l'idrolisi del 1-naftilfosfato a formare l'1-naftolo (incolore) e fosfato. La seconda reazione prevede l'interazione tra 1-naftolo e un sale di diazonio, quale il Fast Red TR. I due composti interagiscono in una reazione non enzimatica a formare un composto di colore rosso. Viene pertanto misurata la U.I. che corrisponde, in questo caso, alla quantità totale di fosfatasi acida. Per conoscere la quantità di fosfatasi acida prostatica bisogna ripetere le due reazioni, aggiungendo anche l'L-tartrato, che inibisce selettivamente la fosfatasi acida prostatica. Si calcola quindi la U.I. relativa alle fosfatasi acide eritrocitarie, macrofagiche e lisosomiali. Si sottrae questo valore di questa U.I. al valore della U.I. calcolato senza l'aggiunto di L-tartrato e si ottiene la quantità di fosfatasi acida prostatica.

Per un dosaggio più preciso della PACP si può fare ricorso a metodi immunoenzimatici (IEA), secondo i quali si utilizza un primo anticorpo che lega specificamente la PACP. Si aggiunge al campione un secondo anticorpo che riconosce e lega i complessi anticorpo 1-PACP e ne causa la precipitazione. Quindi si isola il precipitato e si procede con la reazione sopra descritta.

Il metodo immuno-fluorescente è fra tutti i metodi il più sensibile. Gli anticorpi anti-PACP sono fissati su un supporto solido; una volta avvenuta la reazione antigene-anticorpo e dopo gli opportuni lavaggi, viene aggiunto come substrato per la PACP l'1-naftilfosfato dal quale, per azione dell'enzima, viene liberato 1-naftolo, composto fluorescente.

Intervalli di riferimento per la fosfatasi acida

• PAC Totale: fino a 11 mU/ml
• PACP: fino a 4 mU/ml

Lattato deidrogenasi (LDH)

È un enzima attivo della glicolisi. È largamente diffuso nei tessuti dell'organismo e nelle cellule ha una localizzazione citoplasmatica. Come detto nel capitolo precedente, esistono 5 isoforme dell'enzima LDH: LDH1 e LDH2 (abbondanti nel miocardio e nei globuli rossi); LDH3 e LDH4 (abbondanti nei polmoni, placenta e muscoli scheletrici); LDH5 (presente nel pancreas, insieme all'LDH3, nel fegato e nei muscoli scheletrici).

La determinazione dell'attività enzimatica dell'LDH (totale) viene effettuata con un test ottico semplice (di Warburg). Il test, in generale, si basa sulla differenza di assorbanza, ad esempio, del NADH e del NAD⁺ a 340 nm, perché il NADH è in grado di assorbire a 340 nm (ma anche a 260 nm), mentre il NAD⁺ non è in grado di assorbire a 340 nm. Per la determinazione dell'attività dell'LDH si può utilizzare la reazione dell'ossidazione dell'acido lattico in presenza di NAD⁺ ad acido piruvico e NADH:

acido lattico + NAD⁺ → acido piruvico + NADH

Ma l'LDH non è in grado di catalizzare solo questa reazione, ma è in grado anche di catalizzare la riduzione dell'alpha-idrossibutirrato in presenza di NADH a idrossibutirrato e NAD⁺:

Alpha-idrossibutirrato + NADH → idrossibutirrato + NAD⁺

Quindi miscelando il campione di sangue con alpha-idrossibutirrato e NADH, si misura l'assorbanza al tempo 0 e dopo 3 o 4 minuti sempre a 340 nm. Si parte dalla legge di Lambert Beer: