10. Enzimi del plasma (fosfatasi alcalina e acida, transminasi, ldh, creatina chinasi, amilasi, ggt, colinesterasi, lipasi, oct, gpd, lisozima, ) e metodi di determinazione della loro quantita'

Metodo di misurazione dell'enzima

Questo metodo prevede una prima reazione di conversione dell'alpha-chetoglutarato e aspartato in ossalacetato e glutammato.

L'ossalacetato (o acido ossalacetico) viene ridotto in presenza di NADH attraverso una reazione catalizzata dalla malatodeidrogenasi con formazione di malato e NAD+:

alpha-chetoglutarato + aspartato → ossalacetato + glutammato

ossalacetato + NADH + H+ → L-malato + NAD+

Si segue, quindi, il principio del test ottico semplice secondo il quale si misura la variazione (in questo caso, diminuzione) di assorbanza a 340 nm man mano che il NADH viene convertito a NAD+. Quindi si effettua una misura dell'assorbanza al tempo 0 e poi dopo 3 o 4 minuti sempre a 340 nm. Questa variazione di assorbanza viene correlata alla quantità di enzima come visto nel capitolo precedente.

La alanina aminotransferasi catalizza la conversione dell'alanina e dell'alpha-chetoglutarato rispettivamente a piruvato e glutammato.

Alanina + alpha-chetoglutarato → piruvato + glutammato

chetoglutarato piruvato + glutammato →

I metodi per la determinazione della ALT corrispondono a quelli indicati per la determinazione della AST. In questo caso, il piruvato che si forma dalla reazione catalizzata dalla ALT, viene determinato mediante una reazione accoppiata nella quale è impiegata la lattatodeidrogenasi (LDH):

L-alanina + 2-chetoglutarato piruvato + L-glutammato → + + piruvato + NADH + H lattato + NAD

La diminuzione della assorbanza misurata a 340nm indica la quantità di NADH ossidata ed esprime il valore dell'attività enzimatica.

Sia per ALT che per AST la loro concentrazione sierica non dovrebbe superare 40mU/ml.

CREATINA CHINASI (FOSFOCHINASI o CK o CPK)

Anche la creatina chinasi appartiene alla categoria delle trasferasi come le transaminasi, con la differenza che la creatina chinasi catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato (quindi è una fosfotrasferasi), mentre le transaminasi catalizzano il trasferimento di un gruppo aminico (quindi

Sono delle aminotrasferasi). Più nellospecifico la creatina chinasi catalizza il trasferimento del gruppofosfato dalla fosfocreatina all’ADP con formazione di creatina e ATP,ma catalizza anche la reazione inversa, cioè la fosforilazione dellacreatina a formare fosfocreatina.

Nel capitolo dedicato agli esami delle urine e alla funzionalità renaleè stato detto che la fosfocreatina rappresenta un’importante fontedi energia per muscoli scheletrici, cardiaci e anche per cervello erene. In caso di contrazioni intense, i muscoli richiedono una elevataquantità di energia. Le cellule muscolari possiedono ciascuna unapiccola quantità di ATP già pronta per essere utilizzata. Però l’ATPnon può accumularsi in modo illimitato in un tessuto dal momentoche elevate quantità di ATP nelle cellule hanno un effetto tossico e,quindi, la quantità di ATP presente come riserva non riesce asoddisfare le richieste.

energie principali coinvolte nel processo di produzione di ATP durante l'esercizio intenso sono la fosforilazione a livello del substrato e la fosforilazione ossidativa. Tuttavia, prima che queste reazioni possano essere attivate, è necessario un certo periodo di tempo. Durante questo intervallo, entra in gioco la fosfocreatina, che è presente in grandi quantità nelle cellule. La fosfocreatina trasferisce un gruppo fosfato all'ADP, catalizzato dalla creatin chinasi, per formare ATP. È importante notare che gli eritrociti non contengono creatin chinasi e che l'enzima è presente solo in piccole quantità nel plasma. Esistono tre forme isoenzimatiche della creatin chinasi presenti nel citoplasma, che sono: - CK-MM (presente principalmente nel muscolo scheletrico e anche a livello cardiaco) - CK-MB (presente principalmente a livello cardiaco) - CK-BB (presente nei polmoni, intestino, cervello e utero) Le sigle MM, MB e BB indicano le tre forme isoenzimatiche della creatin chinasi.isoforme(citoplasmatiche) della CK sono costituite ciascuna da due subunità. La lettera "M" sta per Muscle e la lettera "B" sta per Brain. Ogni subunità della CK è costituita da una catena polipeptidica con un centro attivo. L'innalzamento della CK-MB è più precoce di quello degli altri enzimi impiegati per la diagnosi di infarto del miocardio (AST, LDH) ma anche il suo ritorno ai valori normali è più rapido. Altre condizioni in cui si può avere un aumento della CK nel siero sono nei: sforzi fisici intensi, iniezioni intramuscolo, traumi muscolari, ischemia di arti, distrofie muscolari, alcolismo cronico, tetano, epilessia, malattie del sistema nervoso centrale, neoplasie. Se queste tre isoforme sono localizzate a livello citoplasmatico delle cellule muscolari scheletriche, cardiache, cerebrali, polmonari ecc., esiste una isoforma della creatina chinasi localizzata a livello mitocondriale, chiamata, appunto,

creatina chinasi mitocondriali(CK-MT). Anche in questo caso, la creatina chinasi è costituita da due subunità, ma questa volta identiche tra loro. La CK-MT è localizzata nella parete interna della membrana mitocondriale e partecipa al trasporto dell'energia ottenuta dalla fosforilazione ossidativa, attraverso le membrane per un'utilizzazione extra-mitocondriale. Recentemente è stato attribuito alla CK-MT un significato di marker tumorale essendo stata rilevata la sua presenza nel siero in una elevata percentuale di pazienti con carcinoma epatico, gastrico, polmonare, mammario.

Per il dosaggio della CK si può utilizzare il METODO DI OLIVER ROSALKI. Questo metodo spettroscopico si basa sull'impiego di due reazioni ausiliarie. Sicuramente il metodo prevede il trasferimento del gruppo fosfato dalla fosfocreatina all'ADP attraverso una reazione catalizzata dalla creatin-chinasi:

Fosfocreatina + ADP → Creatina + ATP

Dopo che è avvenuta questa

reazione si ricorre a una primareazione ausiliaria, cioè si fa interagire l’ATP che si è formato daquesta reazione con il glucosio attraverso una reazione catalizzatadall’enzima esochinasi (HK), con conseguente formazione diglucosio-6-fosfato e ADP:

ATP + Glucosio → Glucosio-6-fosfato + ADP

Il glucosio-6-fosfato viene, poi, convertito attraverso una seconda+reazione in 6-fosfogluconato in presenza di NADP (che si trasformain NADPH). La reazione è catalizzata dalla glucosio-6-fosfatodeidrogenasi:

Glucosio-6-fosfato + NADP → 6-Fosfogluconato + NADPH + H

Viene quindi misurata la variazione di assorbanza attraverso unamisura al tempo 0 e una 3 o 4 minuti dopo, entrambe condotte a340 nm. La variazione in questo caso si registra come un aumentodi assorbanza. Bisogna ricordare che nel sistema di reazione èopportuno aggiungere la l’N-acetilcisteina, che mantiene l’attivitàdella fosfocreatina, e bisogna aggiungere

l'adenosina2+monoposfato (AMP) e gli ioni Mg .Il dosaggio delle CK può essere effettuato anche mediante elettroforesi: si verifica una diversa migrazione per i 3 isoenzimi. Le bande poi vengono visualizzate osservando in UV la fluorescenza emessa dal NADPH prodotto nella reazione o accoppiando una reazione colorimetrica con sali di tetrazolio.

Un particolare metodo è l'immunoinibizione. Partiamo dal presupposto che ciascuna isoforma CK ha due subunità e ciascuna subunità ha un sito attivo. Quindi ogni subunità ha attività catalitica. Si può pensare di utilizzare un siero contenente gli anticorpi anti-subunità M. Quindi l'isoforma CK-MM viene totalmente inibita, l'isoforma CK-MB avrà un'attività catalitica dimezzata. La CK-BB non risentirà di alcun effetto visto che non è presente nel siero. Quindi con questo metodo si può dosare la sola CK-MB. Dopo aver aggiunto il siero

contenente gli anticorpi anti-subunità M, si procede con il metodo visto precedentemente (Oliver Rosalki). Il risultato ottenuto va moltiplicato per 2 visto che l'attività di CK-MB è dimezzata.

AMILASI

L'amilasi, come le fosfatasi, appartiene alla categoria delle idrolasi; l'amilasi catalizza la scissione del legame alpha-1,4-glicosidico in presenza di una molecola di acqua. In pratica l'amilasi scinde l'amido (polisaccaride di riserva delle piante) e il glicogeno (polisaccaride di riserva degli animali) in molecole più piccole e facilmente assimilabili. Quello che noi assumiamo con la dieta è solo amido, in quanto il glicogeno, dopo la morte dell'animale, è prontamente scisso in glucosio. Si distinguono due tipi di amilasi:

• α-amilasi, abbondante negli animali e nei vegetali. Le alpha-amilasi scindono i legami glicosidici interni dell'amido;
• β-amilasi, abbondante negli animali e nei batteri. Le beta-amilasi scindono i legami glicosidici terminali dell'amido.

beta amilasi scindono i legami glicosidici esterni dell'amido. Quest'enzima si trova prevalentemente nelle cellule del pancreas e delle ghiandole salivari e nei loro prodotti di secrezione ed è presente nel siero e nelle urine. Più precisamente, il 30% di amilasi è di origine pancreatica, il 60% è di origine salivare, il 10% originada fegato, ghiandole sudoripare, muscoli, tessuto adiposo, polmoni. Principalmente si distinguono due fonti di amilasi: una pancreatica e una salivare. La prima è detta tipo S (cioè salivare); la seconda è detta tipo P (cioè pancreatica). L'amilasi di tipo S ha una maggiore capacità di correre su un substrato quando sottoposta a un campo elettrico differentemente dall'amilasi di tipo P. In condizioni normali nel sangue e nelle urine sono presenti solo piccole quantità di amilasi. In seguito a danno delle cellule pancreatiche, come nella pancreatite, o in caso di ostruzione

Il deldotto pancreatico può essere ostruito a causa di calcoli o, più raramente, a causa di un cancro al pancreas. Inoltre, può verificarsi un aumento della concentrazione ematica ed urinaria dell'amilasi in caso di alcolismo e fibrosi cistica. Per determinare la quantità di amilasi si possono utilizzare diversi metodi:

Metodi amiloclastici: questi metodi si basano sull'interazione tra l'amido e lo iodio, che sviluppa una colorazione blu. I metodi colorimetrici utilizzati per determinare l'attività dell'amilasi si basano sulla scomparsa di questa colorazione man mano che l'amido viene digerito dall'amilasi.

Metodo saccarogenico: questo metodo si basa sulla produzione di gruppi riducenti, come il maltosio, derivanti dalla digestione dell'amido da parte dell'amilasi.