10. Crescita microbica: fasi ed equazioni che descrivono la crescita_valutazione della crescita (conteggio cellulare, quantificazione massa cellulare, quantificazione componenti cellulari)

La crescita microbica

La crescita dei microrganismi è descritta come un incremento dei costituenti cellulari che porta all’aumento di dimensioni della cellula batterica, all’aumento numerico della popolazione batterica o entrambe le cose. Se un microrganismo aumenta di dimensioni e non si divide è detto cenocitico.

Curva di crescita di una coltura microbica

La crescita di una popolazione di microrganismi viene studiata tenendo conto della cosiddetta curva di crescita di una coltura microbica. La crescita dei microrganismi che si riproducono per scissione binaria può essere rappresentata mediante un grafico, che esprime la relazione tra il logaritmo del numero di cellule e il tempo di incubazione. Nella curva di crescita si osservano 4 fasi:

Fase lag (o di latenza)

Periodo impiegato dai microrganismi ad adattarsi al nuovo ambiente e, per questo, non avviene aumento del numero di cellule. Anche se non c’è divisione cellulare, la cellula è attivamente impegnata a sintetizzare nuovi componenti: vengono trascritti nuovi geni e prodotte nuove proteine ed enzimi. Il terreno potrebbe essere diverso da quello in cui il microrganismo è cresciuto precedentemente ed è per questo che vengono sintetizzati nuovi enzimi, i quali serviranno a metabolizzare nutrienti diversi da quelli che venivano metabolizzati nel terreno precedente. La durata di questa fase varia considerevolmente a seconda delle condizioni del mezzo di coltura e dei microrganismi (ad esempio, se il microrganismo ha subito un danno potrebbe richiedere più tempo per questa fase per riparare il danno). Quando si trasferisce invece una coltura giovane in fase di vigorosa crescita esponenziale in un terreno fresco e di identica composizione al precedente, la fase di latenza è breve o manca del tutto.

Fase log (o logaritmica o esponenziale)

Durante questa fase i microrganismi crescono a velocità elevata (relativa ovviamente al loro potenziale genetico, alla natura del terreno). Durante la fase esponenziale, la velocità di crescita si mantiene costante, cioè i microrganismi si dividono e raddoppiano di numero a intervalli di tempo regolari.

Fase stazionaria (o idiofase)

La crescita cessa e l’andamento della curva diventa orizzontale. Questa fase si stabilisce quando la popolazione batterica raggiunge la densità di circa 10⁹ cellule per ml. Il numero di organismi vitali rimane costante. Le ragioni per cui una popolazione microbica entra in fase stazionaria sono molte. Una è la limitazione dei nutrienti. Per i microrganismi aerobi un fattore limitante è anche la presenza di ossigeno. La fase stazionaria può essere dovuta anche all’accumulo di metaboliti secondari (come gli antibiotici, utilizzati per ridurre la competizione, ostacolando la vitalità di microrganismi potenziali competitori). Alcuni batteri, in questa fase, attivano delle proteine dette proteine da deprivazione nutrizionale che rendono la cellula molto resistente a possibili danni.

Senescenza o morte

Non tutte le cellule muoiono successivamente alla fase stazionaria, però si ritiene che esse entrino in una fase temporanea di arresto della crescita. Si ritiene che questo fenomeno, in cui le cellule vengono indicate come vitali ma non coltivabili, sia il risultato di una risposta genetica indotta in cellule in fase stazionaria e prive di nutrienti. Quando vengono ripristinate le condizioni ottimali queste cellule tornano ad essere vitali.

Modalità di crescita

Crescita diauxica

Si osserva quando una popolazione microbica cresce in un sistema chiuso in un terreno minimo che contiene due diverse fonti organiche di carbonio (crescita con doppia fase). Nel grafico riportato sotto i batteri inizialmente utilizzano glucosio, che è il substrato preferito. Quando il glucosio termina si attiva la trascrizione del gene della beta galattosidasi e i batteri possono iniziare ad utilizzare il lattosio come substrato energetico, ma crescono più lentamente rispetto alla crescita con il glucosio.

Crescita aritmetica

La crescita avviene in modo lineare (è indotta ad avvenire in questo modo).

Crescita sincrona

Si ha la duplicazione sincronizzata delle cellule. Si ottiene con sistemi di sincronizzazione come dei filtri (dividono le cellule vegetative dalle gemme). Ci permette di avere una popolazione con una crescita sincronizzata.

Misurare la crescita

Durante la fase esponenziale, ogni microrganismo si divide a intervalli di tempo costanti; per questo il numero di cellule della popolazione raddoppia nell’arco di un determinato periodo, detto tempo di generazione (o tempo di duplicazione). Se si considera una determinata specie batterica che si divide, per esempio, ogni 20 minuti. Partendo dal tempo 0 avremo un numero di cellule ben definito che chiameremo popolazione al tempo 0 o popolazione iniziale, dopo 20 minuti si formerà la prima generazione o popolazione al tempo 1 che conterrà il doppio delle cellule rispetto alla popolazione al tempo 0. Dopo ulteriori 20 minuti, quindi dopo 40 minuti dal tempo 0, si formerà la seconda generazione o popolazione al tempo 2 che conterrà a sua volta il doppio delle cellule rispetto alla popolazione al tempo 1 e il quadruplo rispetto alla popolazione al tempo 0. Quindi durante la fase di crescita esponenziale dell'esempio ogni venti minuti, la popolazione batterica raddoppia di numero. Nella fase di crescita esponenziale, pochissime cellule vanno incontro alla morte e quindi il numero di cellule che muoiono è trascurabile rispetto a quelle vive che si dividono.

Per cui il numero di microrganismi di una popolazione in fase di crescita esponenziale è dato sempre da 2ⁿ, dove n è il numero di generazioni. In genere si conoscono il numero di cellule al tempo t (N_t) e il numero iniziale di cellule o numero di cellule al tempo 0 (N₀) (il numero di cellule al tempo t e al tempo 0 si possono conoscere con i metodi di conta cellulare). Da essi si può conoscere il numero di generazioni (n). Infatti:

• N_t = N₀ x 2ⁿ

Prendendo il logaritmo in base 10 dei due membri dell'equazione si ottiene:

• log N_t = log N₀ + (n)log(2)

Da cui:

• n = (log N_t - log N₀) / log(2) = (log N_t - log N₀) / 0.301

La velocità di crescita (o tasso di crescita k) è data dal rapporto del numero di generazioni (n) e il tempo di incubazione (t):

• µ = n/t

Sapendo che n è: n = (log N_t - log N₀) / 0.301

il tasso di crescita diventa:

• µ = (log N_t - log N₀) / (0.301 x t)

Ora è possibile calcolare il tempo necessario affinché la popolazione raddoppi e cioè il tempo di generazione (G). Se la popolazione raddoppia avremo che il numero finale di cellule è uguale a due volte il numero iniziale di cellule:

• N_t = 2 N₀

Sostituendo N_t nell’equazione che definisce il tasso di crescita K e sostituendo nella stessa equazione il tempo t con il tempo G, si ottiene:

• µ= (log (2 x N₀) - log N₀) / (0.301 x G)

Quindi:

• µ = (log 2 + log N₀ – log N₀)/(0.301 x G)

Di conseguenza si ottiene:

• µ = (log 2)/ (0.301 x G)

Sapendo che log2 = 0.301, si ottiene:

• µ = 1/G

L’equazione secondo cui N_T = N₀ 2ⁿ è vera solo per la fase esponenziale e, quindi, anche il tasso di crescita µ non può essere considerato una costante. Il tasso di crescita è, a sua volta, funzione della concentrazione della biomassa (X). La velocità di crescita µ segue la stessa cinetica degli enzimi spiegata dall’equazione di Michaelis-Menten, meglio conosciuta come equazione di Monod, secondo cui:

• V = V_max [S]/ (K_M + [S])

L’equazione appena riportata si riferisce agli enzimi. Data una certa quantità di enzima, la velocità della reazione aumenta in modo quasi direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato in una prima fase, per poi raggiungere un valore massimo (V_max), che viene mantenuto nonostante si continui ad aggiungere substrato. Il raggiungimento della velocità massima è dovuto alla saturazione dei siti attivi delle molecole degli enzimi. Per questo motivo, la velocità massima è anche chiamata velocità di saturazione. Solo aumentando la quantità di enzima è possibile ottenere un ulteriore aumento della velocità, destinata anche in questo caso a raggiungere un valore massimo. K_M è la costante di Michaelis Menten, che coincide numericamente con la concentrazione di substrato necessaria a raggiungere una velocità di reazione uguale alla metà di quella massima.

Volendo esprimere la velocità di crescita microbica attraverso l’equazione di Monod otteniamo:

• µ = µ_max [S]/ (K_S + [S])

In tale espressione S è la concentrazione del substrato in un certo istante, µ_max.