Microbiologia generale - crescita microbica

Introduzione

• La crescita è definita come un aumento dei costituenti cellulari; il processo può portare all’aumento di

grandezza del microrganismo, ad un aumento numerico della popolazione o ad entrambe le cose.

• In un sistema chiuso, la crescita si mantiene esponenziale solo per poche generazione, dopo di che entra in

una fase stazionaria dovuta a fattori come la disponibilità limitata di nutrienti, l’accumulo di sostanze tossiche di

rifiuto. In un sistema aperto con continuo apporto di nutrienti e contemporanea eliminazione delle sostanze

tossiche, la fase di crescita esponenziale può durare molto a lungo.

• La crescita microbica può essere studiata mediante tecniche che permettono di monitorare variazioni nel

numero delle cellule in coltura, nel numero di cellule vive o nella massa totale.

• La crescita microbica è influenzata da diversi fattori ambientali come : disponibilità di acqua, pH dell’ambiente,

la temperatura, la concentrazione di ossigeno, la pressione, le radiazioni ecc. Nonostante ciò molti

microrganismi ed in particolare, batteri si sono adattati a crescere molto bene in condizioni ambientali estreme.

• I batteri sono in grado di comunicare tra li loro ed operare cooperativamente, per mezzo di segnali chimici

dipendenti dalla densità della popolazione.

La crescita è definita come un aumento ordinato dei costituenti cellulari. Se i

microrganismi si riproducono per gemmazione o scissione binaria, la crescita corrisponde

ad un aumento del numero di cellule.

Date le ridotte dimensioni dei microrganismi, per lo studio della loro crescita, è

raccomandato ed usuale lo studio su una popolazione di microrganismi.

Il ciclo cellulare degli organismi procarioti

Il ciclo cellulare è costituito dalla sequenza di eventi che si susseguono tra la formazione

di una nuova cellula e la successiva divisione cellulare.

La riproduzione degli organismi procarioti, avviene in genere per scissione binaria,

mentre in alcune specie procariotiche si può anche osservare la gemmazione e la

frammentazione.

La scissione binaria, corrisponde ad una crescita iniziale della cellula, alla

successiva duplicazione del DNA e separazione dello stesso ai poli opposti della cellula

ed, infine da ciascuna metà, previa formazione del setto trasversale nella regione mediana

della cellula madre, si ricava una cellula figlia con un singolo cromosoma.

Il ciclo cellulare degli organismi procarioti risulta ancora oggi non del tutto compreso.

Comunque due meccanismi agiscono nel corso del ciclo cellulare : la replicazione e la

ripartizione del dna e la citochinesi, tali processi sono contemporanei e si

sovrappongono.

Replicazione e ripartizione cromosomica

I cromosomi della maggior parte degli organismi procarioti sono circolari ed ognuno di

questi reca un sito d’origine della replicazione da cui prende avvio la replicazione del

DNA. La replicazione termina esattamente nel punto opposto al sito d’origine detto sito

terminale.

Nella fase iniziale del ciclo cellulare, la regione di origine e quella terminale migrano verso

il centro della cellula e viene assemblato un gruppo di proteine implicate nella sintesi del

DNA che formano il replisoma in corrispondenza del sito di origine.

Una volta costituitisi i cromosomi figli, le due regioni di origine neoformate migrano verso

le estremità opposte della cellula.

Per molti anni si è creduto che i procarioti non potessero possedere delle strutture

citoscheletriche date le loro dimensioni, ma oggi si riconosce una proteina detta MreB che

è implicata in diversi processi di determinazione morfologica della cellula e migrazione

cromosomica.

Citochinesi

La formazione di un parete trasversale tra le due future cellule figlie è detto settazione.

La citochinesi, termine solitamente usato per descrivere la formazione di due cellule

eucariotiche figlie, viene usato oggi anche per indicare tale processo negli organismi

procarioti.

Il processo di settazione viene diviso in più fasi:

Selezione del sito in corrispondenza del quale verrà costruito il setto

1. Assemblaggio di una struttura speciale detta anello Z (z ring) che suddivide la

2. cellula in due unità per costrizione

Congiunzione dell’anello Z alla membrana plasmatica

3. Assemblaggio dell’apparato di sintesi della parete cellulare

4. Costrizione dell’anello Z e formazione del setto

5.

La proteina FtsZ costituisce l’anello Z.

Curva di crescita microbica

Per l’analisi della crescita di una popolazione microbica uno strumento fondamentale è

costituito dalla curva di crescita di coltura.

Si dice che stiamo trattando una coltura batch o a sistema chiuso, quando i

microrganismi crescono in un mezzo liquido all’interno di un recipiente chiuso con una

quantità limitata di terreno; in questo tipo di coltura non viene aggiunto terreno fresco e la

concentrazione dei nutrienti diminuisce così

come aumenta la concentrazione di sostanze

tossiche di rifiuto.

La crescita degli organismi che si riproducono

per scissione binaria, può essere analizzata

mediante il grafico su citato, che mette in

relazione il logaritmo del numero delle

cellule ed il tempo di incubazione.

Come si può notare dal grafico, in ogni coltura

batch si osservano sempre 4 fasi: la fase di latenza, la fase di crescita esponenziale, la

fase stazionaria ed infine la fase di morte.

Fase di latenza

Tale fase è la prima a presentarsi in ordine di tempo ed è detta anche fase di lag. In

genere quindi, una volta inoculato il terreno con batteri, non si osserva una crescita

immediata del numero di cellule, ma si presenta tale fase.

Ciò non significa che le cellule siano metabolicamente inattive, infatti molto spesso la

cellula è attivamente impegnata nella sintesi di nuovi componenti cellulari.

Una fase di lag può essere dovuta a molti motivi, che comunque infine porteranno alla

crescita della popolazione:

• Cellule vecchie o prive di ATP, cofattori essenziali o ribosomi

• Il terreno può essere quello non usuale in cui quel tipo di batterio cresce, quindi

sono necessari nuovi enzimi al batterio

• I microrganismi possono aver subito un danno e necessitano di tempo per la

riparazione

Come già detto, alla fine, comunque i batteri riusciranno a dotarsi di tutto ciò che è

necessario alla loro replicazione, aumentando la massa ed infine dividendosi.

La durata della fase di latenza può variare notevolmente, dall’essere cortissima o

addirittura del tutto assente oppure durare molto a lungo. La durata dipende

essenzialmente da due aspetti, le condizioni dei microrganismi inoculati nel terreno

ed il mezzo di coltura usato.

Fase esponenziale

Nella fase esponenziale o logaritmica, i microrganismi crescono e si dividono alla

massima velocità possibile rispetto a : loro potenziale genetico, natura del terreno,

condizioni ambiente.

Durante questa fase la velocità di crescita si mantiene costante, i microrganismi si

dividono e raddoppiano di numero a intervalli di tempo regolari.

La fase esponenziale può essere caratterizzata da crescita bilanciata o crescita

non bilanciata: Nel primo caso, tutte le componenti cellulari vengono sintetizzate a tasso

costante le une rispetto alle altre; il secondo caso si presenta quando cambiano i livelli di

nutrienti o altre condizioni ambientali.

La crescita non bilanciata si osserva solitamente in due tipi di esperimento, negli

esperimenti di shift-up, che prevedono il trasferimento della coltura da un mezzo a

concentrazioni ridotte di nutrienti verso un mezzo più ricco, e negli esperimenti di shift-

down, nei quali si ha lo spostamento della coltura da un terreno ricco di nutrienti e

favorevole in un terreno scarseggiante rispetto a nutrienti.

In questi due tipi di esperimenti, si verifica una crescita non bilanciata dovuta al

cambiamento delle condizioni fornite ai microrganismi che devono adattarsi e quindi

modificare le loro strategie di crescita, ciò dimostra che la crescita microbica è soggetta ad

un controllo molto preciso e coordinato e risponde rapidamente a cambiamenti delle

condizioni ambientali.

Quando la crescita microbica è limitata dalla bassa concentrazione di un nutriente

necessario, la crescita finale netta o resa totale in biomassa aumenta proporzionalmente

alla quantità iniziale del nutriente limitante. Anche il tasso di crescita aumenta con la

concentrazione del nutriente ma il grafico ha andamento iperbolico.

La fase stazionaria

Dopo la un certo periodo di tempo, l’andamento del grafico diventa orizzontale, è l’inizio

della fase stazionaria, una fase di stasi per quanto riguarda il grafico ed il numero totale

delle cellule, ma non di certo per la popolazione. 9

Questa fase si stabilisce quanto la popolazione batterica raggiunge la densità di circa 10

cellule per ml, anche se alcuni microrganismi di norma non raggiungono tale densità.

Il numero totale di microrganismi vivi rimane costante, e ciò può dipendere dall’equilibrio

tra i processi di divisione e di morte cellulare oppure dal fatto che la popolazione può

semplicemente cessare di dividersi pur rimanendo metabolicamente attiva.

La ragioni per le quali la popolazione microbica può entrare in tale fase per diversi motivi,

tra i quali, il principale è la limitazione di nutrienti, oppure ad esempio per gli organismi

aerobi, la disponibilità di O può diventare un fattore limitante, così come l’accumulo di

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sostanze tossiche di rifiuto.

A volte la mancanza di nutrienti può essere un’esperienza positiva per molti batteri

che non rispondono a profondi cambiamenti morfologici, come ad esempio la formazione

di endospore, ma solo con una lieve diminuzione delle dimensioni complessive ed una

profonda modificazione genica e fisiologica. Questi batteri spesso producono un’ampia

gamma di proteine da deprivazione nutrizionale o starvation proteins che rendono la

cellula molto resistente ai possibili danni. Queste proteine intensificano i legami crociati

del peptidoglicano e la forza della parete cellulare e sono così efficaci che i batteri

riescono a sopravvivere alla carenza di nutrienti per anni.

Alcune evidenze suggeriscono che in condizioni di scarsità di nutrienti, aumenta la

virulenza di Salmonella typhimurium e di altri batteri patogeni.

Fase di morte o senescenza

Questa fase di morte è attualmente oggetto di controversi e sono state formulate due

ipotesi alternative.

Alcuni microbiologi affermano che le cellule sottoposte a deprivazione nutrizionale e

declino esponenziale della densità non perdono irreversibilmente la capacità di riprodursi

ma piuttosto entrano in una fase temporanea di arresto della crescita e le cellule si dicono