1. Danno, morte e adattamento cellulare

APOPTOSI

Morte cellulare ben programmata. La cellula attiva un programma suicida tramite

attivazione di enzimi che degradano le sue stesse componenti in maniera “pulita e

ordinata”. La membrana cellulare della cellula rimane intatta ma viene modificata e si

formano i cosiddetti bleebs (estroflessioni citoplasmatiche) che poi si distaccano

sottoforma di corpi apoptotici, eliminati tramite fagocitosi prima che il loro contenuto

possa liberarsi nell’ambiente extracellulare. In questo modo non si ha infiammazione. Il

caduta

termine “apoptosi” indica in greco la dei petali da un fiore o delle foglie da un

albero, e ci rimanda all’aspetto caratteristico della cellula apoptotica. L’apoptosi attivata

da determinati stimoli patologici può evolvere in necrosi.

Apoptosi fisiologica - L’apoptosi è un processo fisiologico che consente di eliminare

cellule potenzialmente pericolose perché danneggiate o infette, o che hanno terminato il

loro ciclo vitale.

In una determinata massa cellulare, il numero di cellule è mantenuto fisiologicamente

costante dal nostro organismo attraverso i processi di mitosi (produce cellule) e apoptosi

(elimina cell non necessarie).

L’ipoplasia condizione in cui abbiamo una diminuita presenza di cellule; può essere

dovuta ad una alterazione di uno di questi due processi (diminuita mitosi o aumentata

apoptosi)

L’iperplasia è dovuta ad aumentata mitosi o diminuita apoptosi (opposta all’ipoplasia)

Nelle neoplasie è presente un’alterazione che riguarda entrambi i processi; il ciclo

cellulare diverso da quello fisiologico ed apoptosi inibita.

Si noti come il processo apoptotico sia coinvolto anche in alcuni meccanismi

patogenetici.

Apoptosi patologica - L’apoptosi è patologica quando atta all’eliminazione di cellule

danneggiate in modo irreversibile, senza scatenare risposte infiammatorie e riducendo

quindi al minimo il danno tissutale. L’apoptosi interviene in caso di:

danno irreversibile del DNA;

• accumulo di proteine malripiegate;

• alterazioni cellulari causate da infezioni, soprattutto virali (in questo caso le cellule

• infette attivano il processo apoptotico mediato dalle cellule del sistema immunitario che

rimuovono il serbatoio infettivo);

atrofia patologica negli organi parenchimatosi in seguito ad ostruzione dei dotti, come

• avviene nel pancreas, nelle parotidi e nel rene.

MORFOLOGIA DELLA CELLULA APOPTOTICA

Attivata l’apoptosi il volume cellulare inizia a ridursi, gli organuli si ammassano e la

cromatina inizia a condensarsi. Si formano delle estroflessioni della membrana plasmatica

(blebs) che poi si distaccano formando i corpi apoptotici, vescicole delimitate da

membrana contenenti citoplasma e organuli. La cellula assume quindi un aspetto a

grappolo e da un nucleo tondo ed omogeneo vedo un nucleo "a pallini". I corpi apoptotici

vengono fagocitati senza alcuna risposta immunitaria.

Per analizzare la percentuale di apoptosi in un tessuto, conto quante cellule a grappolo e

quante non. Il grappolo è tipico dell’apoptosi.

Immagine bianco e nero: le parti scure rappresentano materiale nucleare; il nucleo si

frantuma e si formano corpi apoptotici. 11

—> La morfologia tipica ci permette di identificare la % di apoptosi.

protesi a cisteina,

L’apoptosi deriva dall’attivazione di enzimi definiti CASPASI, che

tagliano substrati proteici in corrispondenza di determinate sequenze e sempre dopo un

residuo di acido aspartico (Asp).

Le caspasi vengono attivate per mezzo di un primo taglio proteolitico che divide la catena

polipeptidica in due diverse subunità, seguito da un secondo taglio che rimuove la

porzione N-terminale.

La loro attivazione è irreversibile: una volta attivate si ha sicuramente morte cellulare.

Una volta attivate lisano altre caspasi con un processo a cascata. Attualmente si

conoscono 14 membri della famiglia delle caspasi, suddivise in due gruppi principali in

base alla loro specificità di substrato:

•Caspasi “iniziatrici”: portano all’attivazione delle “effettrici”. Esempi sono la 8 (o la 10

nell’uomo) e la 9.

•Caspasi “effettrici”: agiscono più a valle nella cascata proteolitica. Esempio è la 3. La

caspasi 3 è la cascassi effettrice di entrambe le vie, attiva cioè processi apoptotici

comuni ad entrambe le vie (formazione di blebs ecc..), la sua analisi non ci permette di

capire che via si sta attuando.

In base alla prima caspasi che viene attivata possiamo capire

via estrinseca

se l’apoptosi viene attivata attraverso una (o

intrinseca

via dei recettori di morte) o (o mitocondriale).

La caspasi inattiva iniziale è chiamata PROCASPASI; la prima

caspasi attivata nella via intrinseca è la procas-9, nella

estrinseca la procaspasi-8.

Facciamo elettroforesi + westernblott ed utilizziamo Ab

specifico per Pro-cas9: se ho una banda la via è inattiva, se

ho 2 bande la via è stata attivata tramite proteolisi.

Le caspasi, oltre che a degradare direttamente le proteine del

citoscheletro, attivano una DNAsi citoplasmatica che

produce una caratteristica frammentazione del DNA.

Se analizzo un campione con morte cellulare e voglio sapere

se necrosi o apoptosi vado a separe in gel di agarosio il DNA

(EL), in cellule apoptotiche (B) ho una strisciata ma con delle 12

bande distinguibili (taglio preciso con endonucleasi); Nella necrosi (C) ho tante porzioni di

DNA tagliate in maniera casuale, una strisciata unica senza bande.

Nell’apoptosi abbiamo quindi due vie:

1. Mitocondriale o da stress o intrinseca - lo stesso mitocondrio avverte lo stimolo

nocivo -> liberazione di citoC -> attivazione cascata di caspasi.

2. Recettoriale o fisiologica o estrinseca - molecole del nostro organismo possono

attivare il processo quando necessario tramite legame con il ligando -> trasduzione

del segnale -> attivazione caspasi.

VIA INTRINSECA

La via mitocondriale è attivata da: stress, temperatura, radiazioni ionizzanti ecc…

I mitocondri contengono varie proteine pro-apoptotiche, tra le quali il citocromo C. Il

destino della cellula dipende in gran parte dalla permeabilità e dalla sopravvivenza dei

mitocondri. Possiedono inoltre proteine anti-apoptotiche come le BCL2 che impediscono

fuoriuscita del citocromo C, ma anche delle proteine pro-apoptotiche sensibili al danno

tra cui BAX e BAK. Queste dimerizzano per formare un poro che permette la fuoriuscita

del citocromo C. La sintesi di proteine proapoptotiche e antiapoptotiche è stata associata

alla presenza di geni oncogeni ed oncosoppressori. Oncogene = gene che viene attivato

durante il processo tumorale per esprimere una proteina, in questo caso BCL2 che

impedisce la fuoriuscita di citocromo C. In condizioni fisiologiche l’oncogene non è attivo.

Dopo il suo rilascio nel citosol il

citocromo c interagisce con una

proteina citosolica, Apaf-1,

proteina adattatrice, e va incontro

a oligomerizzazione, formando un

complesso intracellulare

multiproteico chiamato

“apoptosoma”. Apaf-1 può

reclutare la pro-cas9 che quindi si

attiva tramite taglio proteolitico.

L’attivazione della caspasi 9 porta,

poi, all’attivazione della caspasi 3,

esecutrice del programma

apoptotico.

Altre proteine mitocondriali

fuoriescono dal mitocondrio e

vanno a legare, neutralizzando,

proteine anti-apoptotiche

citoplasmatiche, le IAP (nhibitors

of apoptosi) 13

VIA ESTRINSECA

Molte cellule esprimono sulla loro membrana i cosiddetti “recettori di morte”, presenti

anche sulla membrana dei corpi apoptotici. Questi recettori appartengono in gran parte

alla famiglia dei recettori del fattore di crescita tumorale TNF. I più comuni sono TNF di

tipo I e FAS.

I segnali intercellulari che permettono la rimozione di cellule non necessarie durante lo

sviluppo e l’omeostasi tessutale sono quindi ligandi di questi recettori: citochine,

corticosteroidi, FAS-L (ligando di FAS, proteina espressa sulla membrana dei linfociti-T

attivati).

I recettori presentano 3 domini (extracellulare; trans-membrana; intracellulare). Quando il

ligando non è legato al recettore ci sono 3 forme monometriche del recettore, il legame

produce una trimerizzazione con attivazione della sua funzione proteolitica dal dominio

citoplasmatico, detto anche dominio di morte DD (Death Domains). Al DD viene reclutata

una proteina adattatrice FADD (Fas-associated Death Domain) che ha una parte simile al

dominio di morte del recettore, ed una parte attraverso la quale interagisce con la

cascassi iniziatrice. Il complesso

formatosi è definito DISC (Death-

Inducing Signaling Complex),

complesso multiproteico che attiva

la caspasi-8 (10 nell’uomo). Questa

a sua volta attiva la caspasi-3

effettrice.

Per quanto riguarda il recettore TNF,

il meccanismo è uguale: anche in

questo caso la caspasi 8 è infine

responsabile dell’attivazione della

caspasi 3.

Alcune proteine cellulari anti-

apoptotiche, come FLIP, bloccano

l’attivazione delle caspasi agendo a

livello dei recettori di morte.

APPLICAZIONE APOPTOSI A LIVELLO SPERIMENTALE: I CAMPI MAGNETICI

Abbiamo usato calamite per capire se la parte statica dei campi magnetici potesse avere

effetti dannosi sulla salute. Usando cellule tumorali, trattate con campi magnetici per

attivare processo apoptotico ed inserirci il campo magnetico. SCOPO: il campo

magnetico è responsabile dello sviluppo di tumore, o affinché avvenga la trasformazione

tumorale è necessario che lo stress sia già presente + campo elettromagnetico?

Puromicina (attivatore apoptosi) + campo vs campo da solo

Risultato: di per se il campo non ha effetto in condizioni fisiologiche ma se l’apoptosi è

attiva perché la cellula è danneggiata, il campo inibisce l’apoptosi. Inoltre questo effetto

del campo magnetico si ha solo nelle cellule che attivano l’apoptosi con il calcio (quindi

cellule del sistema immunitario). 14

ESEMPI DI APOPTOSI

Quando abbiamo l’apoptosi in condizioni patologiche?

• Deprivazione dei fattori di crescita: i linfociti che non vengono stimolati da antigeni,

citochine e i neuroni privati del fattore di crescita delle cellule nervose vanno

incontro ad apoptosi.

• Danno al DNA, dovuto ad esempio a radiazioni o chemioterapici. Quando ci sono

danni al DNA, il gene oncosoppressore p53 interviene.

Il danno al DNA induce accumulo di proteina p53, che arresta il ciclo cellulare nella

fase G0, per permettere ai meccanismi di riparazione di riparare il danno. Se il

danno è troppo grave e non può essere riparato la p53 attiva l’apoptosi (stimola la

produzione di prote