Tossicologia forense

Fase mobile (gas) e fase stazionaria di natura solida, la GC è composta da un

alimentatore di gas inerte (che non interagisce con le molecole) come l’elio o l’argon,

in alcuni casi anche l’azoto viene utilizzato come gas trasportatore; questo gas arriva

all’iniettore dove si inserisce la miscela in esame. Quando inserisco la miscela devo

vaporizzarla per farla entrare nella colonna cromatografica di tipo capillare con

diametro interno inferiore a 1mm e lunga (fino a 90metri). Si arriva poi al rilevatore

che registra il segnale analitico dato da un rumore di fondo e un picco cromatografico

che rappresenta l’uscita di uno o più analiti.

La colonna cromatografica può essere capillare o impaccata.

Spettrometria di massa: tecnica che consente di valutare e analizzare analiti in base al

rapporto di massa su carica. Si basa su ioni e l’analizzatore è in alto vuoto. È collegato

alla cromatografia tramite un’interfaccia che opera la ionizzazione e portano in fase

gas, questa interfaccia dovrebbe:

- Trasferire quantitativamente ciascun eluente

- Ridurre la pressione ad un livello

L’introduzione delle colonne capillari ha consentito di eliminare il problema

dell’interfaccia

Il vuoto è prodotto da un sistema di pompaggio a doppio stadio costituita da una

pompa rotativa di basso vuoto e una pompa ad alto vuoto turbomolecolare o diffusiva

in bagno d’olio. Le sorgenti di ionizzazione in GC sono l’impatto elettronico (EI),

sorgente di tipo hard, una forte ionizzazione dell’analita tramite un piccolo filamento

caricato (70 eV) e fatto collidere con la molecola, questa collisione produce

l’estrazione di un elettrone dalla molecola di interesse e la possibile frammentazione

della molecola. La ionizzazione chimica (CI)

Analizzatori di massa:

- Quadrupolo

- Trappola ionica

- Tempo di volo (TOF)

La sorgente ionica è importante per trasportare le sostanze di interesse, essa è

presente in forma di gas in alto vuoto

Le sorgenti ioniche per liquido massa sono:

- Electrospray ionization (ESI): evaporazione veloce della fase mobile acquosa

con conseguente esplosione delle cariche a causa dell’esplosione di Coulomb

all’altezza del rilevatore -> spettrometro di massa. La fase mobile passa in un

elettrodo cavo di piccole dimensioni. La sensibilità si alza abbassando il flusso

perché meno fase mobile ho, più riesco a vaporizzarla. Serve un buon

compromesso tra il miglior flusso e la miglior sensibilità per lo spettrometro di

massa. Il metanolo evapora più facilmente dell’acqua, poiché ha un punto di

ebollizione più basso; questo dona più sensibilità alla tecnica ma serve una

parte acquosa affinché si separino gli analiti da analizzare. Nell’ESI troviamo

l’effetto matrice (Ion Suppression), che ha un’influenza superiore e va

monitorato, questo effetto è definito coperta in quanto può essere presente una

macromolecola rimasta dopo purificazione che potrebbe catturare le cariche

dell’analita che voglio analizzare, il quale non risulterebbe in quanto privato

degli ioni.

- APCI: ionizzazione liquida in pressione atmosferica. Qui uscirà una fase mobile

non ancora vaporizzata, grazie al calore donato all’uscita dall’elettrodo e un ago

che funge da elettrodo, la soluzione arriva a vaporizzazione e viene caricato

dall’ago. La soluzione ionizzata deve cedere i protoni, in quanto presenti in

forma instabile, alla nostra molecola di interesse che, ionizzata, verrà analizzata

dallo spettrometro di massa. Più il flusso è elevato e maggiore sarà la sensibilità

del test. L’effetto matrice è meno rilevante in quanto la fase mobile è più mirata

e in grado di ionizzare le nostre molecole di interesse. La fase mobile mirata può

essere anche uno svantaggio nel caso in cui ho molte molecole da rilevare.

Lo spettrometro di massa più utilizzato è il quadrupolo, basato su quattro barre

caricate alternativamente, due verticali e due orizzontali, a questi elettrodi vengono

applicati dei potenziali costanti e oscillanti, uguali in ampiezza ma di segno opposto. In

frazioni di millesimi di secondo la corrente si alterna e lo ione verrà respinto e inizierà

ad acquisire energia cinetica basata sulla sua massa, verrà accelerato e letto

dall’elettromoltiplicatore.

Tandem Mass Spectrometry (MS-MS): tre quadrupoli messi in sequenza, la seconda è

detta cella di collisione, dove aumenta la fase gas, le altre due lavorano in alto vuoto.

Nella cella due tendenzialmente si inserisce azoto, che collide con lo ione accelerato,

frammentandolo; analizzando i frammenti ionici sono più sicuro sia quella molecola

perché analizzo la struttura chimica.

Limiti di rilevabilità e rilevazione:

- LOD (Limit Of Detection): concentrazione più bassa che posso identificare ma

non quantificare con un metodo

- LOQ (Limit Of Quantification): concentrazione più bassa che posso identificare e

quantificare

In un tracciato cromatografico si utilizza l’unità S/N -> Signal/Noise, segnale su

rumore. Questa analisi può essere effettuata in full scan, product ion, Selected

reaction Monitoring (SRM) -> con miglior sensibilità.

Analisi di screening: analisi immunochimica o immunoenzimatica, con alta

sensibilità e relativamente bassa specificità.

Analisi di conferma: deve mantenere possibilmente a zero i falsi positivi. Tra queste

GC-MS, LC-MS, GC-HRMS, LC-HRMS. HR sta per alta risoluzione e lavora sui

decimali, per esempio una massa con 5 cifre decimale che riesco ad evidenziarla in

mezzo a molecole con una massa unitaria identica.

La validazione si rifà a linee guida dei tossicologi forensi tra cui:

- Sensibilità, specificità e selettività, dove selettività e specificità ci consentono di

valutare fattori endogeni e/o esogeni che possono interferire con

l’identificazione di una molecola, producendo un falso positivo. Per testare la

sensibilità vado a scalare l’analita, quando raggiungo il S/R di 3 raggiungo il LOD

e con un rapporto di 10 raggiungo il LOQ. Per la specificità e la selettività

analizzo più urine, per esempio 20 urine, 10 con una percentuale nota di analita

più farmaci, che rappresentano la quota esogena, e 10 senza e con altri analiti

esogene come farmaci, analizzo e valuto le interferenze.

- Linearità: studiata aggiungendo un analita a concentrazioni crescenti nel range

che voglio analizzare, effettuando una curva di calibrazione con almeno 6 punti

escluso il bianco. I 6 punti vanno preferibilmente distribuiti in modo da

rispecchiare le percentuali di accuratezza e precisione.

- Accuratezza e precisione intraday e interday: mediante l’allestimento di controlli

di qualità a concentrazioni note distribuite omogeneamente nell’interno

dell’intervallo della curva. Accurato e preciso se al punto più basso della curva

di calibrazione la concentrazione è +- 20%, ai valori medi +- 15% e ai valori alti

+- 10%.

Devono essere soddisfatti parametri come

- Effetto di trascinamento (effetto memoria o carry-over): dovuto al fatto che

alcuni analiti non vengono ben trasportati all’interno del sistema

cromatografico, ci sarà quindi un trascinamento e dei falsi positivi successivi; si

studia mediante l’iniezione di un bianco subito subito dopo il punto più alto della

curva di calibrazione.

- Effetto matrice: fenomeno di Ion Suppression, situazione in cui la presenza di

altre molecole nella matrice biologica analizzata possa influire sull’intensità del

picco cromatografico registrato, particolarmente importante in LC-MS con

ionizzazione ESI. Per valutare l’effetto matrice devo confrontare l’analisi del

campione a diverse concentrazioni con un’altra soluzione contenente analita ma

senza matrice biologica, se ottengo lo stesso segnale non è presente effetto

matrice.

- Recupero: valuta la percentuale di analita perso durante la preanalitica di un

campione, si valuta analizzando successivamente e confrontando due soluzioni

con % nota di analiti.

- Stabilità: studiata durante il processo analitico e a seguito di cicli di

congelamento/scongelamento del campione nel breve, medio e lungo periodo.

- Standard interno: avente proprietà strutturali ovvero caratteristiche chimico-

fisiche del tutto simili alla molecola oggetto di indagine. Lo inserisco all’inizio

della fase preanalitica e devo trovarlo nella traccia finale risultante dall’analisi.