Terapia genica nelle malattie umane

TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE UMANE

La terapia genica è l'utilizzo farmacologico degli acidi nucleici.

Essa comprende la terapia genica per le malattie genetiche ma non è solo questo.

E' necessario fare due distinzioni:

 terapia genica che utilizza sequenze codificanti (cDNA o mRNA): è utilizzata per:

malattie genetiche: viene utilizzata per ripristinare la funzionalità delle proteine che sono

1. state perdute.

Es nella distrofia di Duchenne manca la distrofina quindi si cerca di far esprimere questa

proteina

produzione di proteine terapeutiche nel corpo dei pazienti quali insulina (diabetici),

2. VEGF (infarto del miocardio per favorire la rivascolarizzazione), eritropoietina (anemie)

ecc.

In questo caso si utilizzano i tessuti come bioreattori per formare le proteine terapeutiche

produzione di vaccini ad mRNA: il vaccino ad mRNA fa produrre una proteina che porta

3. all'attivazione della risposta immunitaria

inibire la replicazione di agenti infettivi: facendo produrre proteine specifiche per la

4. risposta antivirale

eliminare cellule aberranti: riguarda tutta l'immunoterapia dei tumori basata sulla

5. stimolazione del sistema immunitario

ingegneria tissutale

6.

 terapia genica che utilizza sequenze non codificanti: le sequenze non codificanti sono

quelle che non codificano per una proteina.

La terapia genica che utilizza sequenze non codificanti si avvale di: oligonucleotidi

antisenso, RNA antisenso, miRNA, siRNA, costrutti CRISPR, base-editing (cambiare una

base con un'altra).

Le applicazioni di questa terapia genica sono molteplici:

inibire la replicazione di agenti virali infettivi

1. eliminare cellule tumorali (cellule aberranti)

2. cercare di trattare malattie in cui si ha un'espressione di dominanti negativi (inibire

3. l'espressione di geni mutanti dominanti negativi): ci sono patologie genetiche dovute a

mutazioni negative.

In queste malattie non si devono aggiungere copie del gene ma si deve eliminare la proteina

difettosa e quindi silenziare il gene che la codifica

alterare il processo di splicing: per rimuovere l’esone mutante dal trascritto o indurre

4. escissioni esoniche (exon-skipping) specifiche che consentono il ripristino del frame di

lettura della proteina.

Cioè è possibile utilizzare questo approccio per alterare il processo di splicing in un modo

che permetta di rimuovere la regione mutata dal trascritto.

Se una mutazione manda fuori frame il registro di lettura, si allarga la delezione e si

ripristina il registro di lettura; questo consente la produzione di proteina (che sarà più corta)

che altrimenti, per il processo di mRNA decay, verrebbe degradata

CRISPR-Cas: è possibile produrre RNA guida per il gene editing promosso mediante la

5. tecnologia CRISPR

produrre RNA o DNA aptameri: gli aptameri sono molecole di acido nucleico che legano

6. specifici motivi proteici (in maniera indipendente dall'appaiamento tra basi).

Agiscono in maniera simile agli Ab ma sono basati su RNA o DNA (non su proteine).

Possono essere utilizzati in terapia

DEFINIZIONE DI TERAPIA GENICA

La definizione di terapia genica fornita dall'EMA è leggermente diversa rispetto a quella fornita

dall'FDA.

Definizione dell'Agenzia europea per i medicinali (EMA): i medicinali di terapia genica (GTMP)

sono generalmente costituiti da un vettore o da una formulazione/sistema di rilascio contenente un

costrutto genetico ingegnerizzato per esprimere uno specifico transgene ("sequenza terapeutica")

per la regolazione, riparazione, sostituzione, aggiunta o delezione di una sequenza genetica. Il

principio attivo è l'acido nucleico sequenza(i), o microrganismo(i), virus(i) o cellule geneticamente

modificati. Il principio attivo può essere composto da più elementi. Utilizzando tali costrutti di

terapia genica, è possibile ottenere la regolazione genetica in vivo o la modificazione genetica delle

cellule somatiche. I vettori utilizzati nei GTMP possono essere progettati per mirare a tessuti o

cellule specifici o per garantire la sicurezza del GTMP (delezione di geni associati a virulenza,

patogenicità, immunotossicità o capacità di replicazione).

Definizione della Food and Drug Administration (FDA) statunitense: la terapia genica umana

cerca di modificare o manipolare l'espressione di un gene o di alterare le proprietà biologiche delle

cellule viventi per uso terapeutico. La FDA generalmente considera che i prodotti di terapia genica

umana includano tutti i prodotti che mediano i loro effetti attraverso la trascrizione o la traduzione

di materiale genetico trasferito, o specificamente alterazione delle sequenze genetiche dell'ospite

(umano). Alcuni esempi di prodotti di terapia genica includono acidi nucleici (ad es. plasmidi, acido

ribonucleico (RNA) trascritto in vitro), microrganismi geneticamente modificati (ad es. virus,

batteri, funghi), nucleasi sito-specifiche ingegnerizzate utilizzate per l'editing del genoma umano e

cellule umane geneticamente modificate ex vivo.

La definizione dell'FDA è più ampia.

STORIA DELLA TERAPIA GENICA

Nel 1960 grazie alla scoperta dei retrovirus è stato scardinato il dogma centrale della biologia.

L'idea di terapia genica è nata negli anni '60 con la scoperta dei retrovirus.

Nel 1966 Dulbecco fu il primo a parlare (si parla a livello teorico) dell’utilizzo dei virus per

correggere genetici nell’uomo. In particolar modo aveva dimostrato che il DNA del virus SV40

(virus oncogenico delle scimmie) può trasformare cellule bersaglio integrandosi nel genoma di

suddette cellule.

Nel 1968 si è iniziato a studiare il codice genetico. Uno degli approcci utilizzati consisteva nel

generare RNA artificiali per poi introdurli nel virus delle piante (virus del mosaico del tabacco).

Esso è un virus molto semplice che si autoassembla (mettendo assieme RNA e proteina).

Si è visto che questi RNA sintetici (poliRNA) venivano trascritti come polilisina (infatti gli RNA

erano formati da AAA).

Nel 1970 si è visto che infettando i pazienti, utilizzando un virus non patogeno umano che si

pensava contenesse il gene dell'arginasi, si è assistito al primo tentativo di terapia genica.

Negli anni '70 sono nate le tecnologie del DNA ricombinante (enzimi di restrizione, plasmidi, ecc.).

Negli anni '80 sono stati sviluppati i primi vettori.

Un vettore è un qualunque cosa che permette di introdurre materiale genetico esogeno nel bersaglio

(cellule in coltura, paziente in vivo).

I primi vettori ad essere stati sviluppati erano vettori virali; essi erano basati sul virus della

leucemia murina di moloney MoMLV.

Esso è un virus ad RNA.

Negli anni '80 sono stati condotti i primi esperimenti teorici.

Si è visto che un difetto dei linfociti potesse essere corretto con trasferimento genico

Negli anni '90 è stato condotto il primo esperimento di trial clinico di terapia genica.

Esso riguardava i pazienti affetti da ADA (adenosina deaminasi, proteina necessaria per la

maturazione dei linfociti).

I bambini affetti da ADA sono molto immunodeficienti ed erano chiamati bubble babies; essi

possono sopravvivere solo in ambienti altamente sterili (questi bambini sono definiti bubble

babies).

Si erano trasdotti i linfociti periferici (ovvero linfociti maturi, non staminali del midollo osseo come

si effettua al giorno d’oggi) di questi bambini.

Inizialmente la terapia funzionava.

Negli anni '90 sono stati condotti ulteriori trial.

Si sono provate numerose terapie.

Nel 1999 si è verificato il primo episodio di SAE grave effetto avverso (effetti collaterali gravi); il

paziente è morto in conseguenza ad una terapia genica. Questo evento, che si è successivamente

verificato più volte durante i trial clinici di terapia genica, era dovuto all’induzione di quello che

viene chiamato ad tempesta citochinica (risposta iperinfiammatoria) in risposta alla

somministrazione di alti dosaggi di adenovirus.

La tempesta citochinica è uno degli eventi più pericolosi.

VETTORI PER LA TERAPIA GENICA

Come si riesce a veicolare il carico terapeutico (acidi nucleici) nel sito di interesse?

Ci sono essenzialmente due approcci utilizzati per veicolare gli acidi nucleici nel sito di interesse

ovvero due tipi di vettori per la terapia genica:

 vettori virali: ve ne sono di diversi tipi.

I più utilizzati sono retrovirus, adenovirus, adenoassociati, herpes simplex e lentivirus (come

HIV)

 vettori sintetici: possono essere:

1. basati su lipidi

2. basati su nanoparticelle: esse possono essere polimeri o metalli

3. basati sul DNA nudo

Tutto ciò che non è vettore virale viene definito vettore sintetico.

CARATTERISTICHE IDEALI DI UN VETTORE DI GENE THERAPY

A prescindere dal tipo di vettore, le caratteristiche ideali sono:

 facilità di produzione: questo costituisce un problema soprattutto per i vettori virali.

I vettori virali, per poter essere formati, richiedono numerosi passaggi su cellule vive quindi

sono complessi per la produzione e per la purificazione.

I vettori sintetici sono più semplici da manipolare.

Anche i costi sono diversi

(Easy production: It should be easy to produce at high titer on a commercial scale. This

consideration stems also from the wide range of cell numbers that must be targeted: from a

handful of stem cells capable of reconstituting the entire hematopoietic repertoire to billions

of cells to reach in the liver or skeletal muscle. For widespread use, the vector should be

amenable to commercial production and processing (such as concentration technology for

delivery in small volumes) and should have a reasonable shelf-life for transport and

distribution. )

 durata dell'effetto: la durata dell'effetto dipende da cosa si vuole trattare.

Ad esempio se si vuole trattare una malattia genetica (con la produzione di un gene

terapeutico) si cerca di ottenere una terapia che durata per tutta la vita del paziente; se si

tratta invece di una terapia genica di un tumore, si cerca di introdurre il gene suicida per una

durata limitata.

In base alla durata da ottenere si scelgono approcci diversi

(Sustained vs. short-term effect: When treating genetic diseases, the therapeutic effect

should persist over a sustained period. Gene expression should also be regulated in a precise

way, as different disease states have different requirements (for example, regulated

expression in diabetes and lifetime expression in haemophilia). For the treatment of acquired

diseases, short effect might suffice or even be advisable )

 immunologicamente inerte oppure no: dipende dagli usi.

Se si inietta una molecola terapeutica nel paziente non si vuole che questa attivi il sistema

immunitario del paziente e che quindi venga eliminata.

Tuttavia, esistono dei casi in cui s