7 a. Terapia genica: proteine eterologhe, trasferimento di geni terapeutici per la cura di malattie genetiche + esempi di malattie curate con la terapia genica

Vari trattamenti per le malattie genetiche

Ogni malattia che abbia o meno una causa genetica può essere trattata con metodi diversi: può essere trattata utilizzando proteine eterologhe, oppure utilizzando vaccini geneticamente modificati o anche anticorpi geneticamente modificati e così via.

Proteine eterologhe per la cura di malattie genetiche

Alcune malattie genetiche, dovute alla carenza di uno specifico ormone o proteina del sangue, ad esempio, possono essere trattate con la somministrazione dall'esterno della proteina mancante e creata attraverso le tecniche del DNA ricombinante. Come visto nel capitolo dedicato alle proteine eterologhe, queste, solitamente, vengono prodotte in cellule ospiti, quali cellule di E.coli, cellule di lievito o cellule ovariche di criceti cinesi. Molto spesso, però, la concentrazione di proteine eterologhe richieste è così elevata che la loro produzione attraverso le cellule ospiti appena elencate non riesce a soddisfare il fabbisogno mondiale di quella determinata proteina.

Quindi, al posto di queste cellule ospiti vengono utilizzati animali transgenici, in quanto consentono la produzione di proteine purificabili in grandi quantità; per esempio, una possibile strategia consiste nell'esprimere la proteina in modo che venga secreta nel latte. Se il gene di interesse viene messo sotto l’azione di un promotore forte come quello della caseina, è chiaro che esso si attiva solo a livello della ghiandola mammaria, senza andare a deturpare o alterare la fisiologia delle altre cellule. Inoltre, una proteina farmacologicamente attiva, secreta con il latte, non dà effetti secondari all'animale transgenico che la produce e subisce modificazioni post-traduzionali compatibili con quelle dell’uomo. Ad esempio, a livello della ghiandola mammaria i bovini transgenici è stato fatto produrre il fattore IX della coagulazione, utilizzato per la creazione di farmaci utilizzati per il trattamento di pazienti emofilici.

Terapia genica per la cura delle malattie genetiche

Per il trattamento delle malattie genetiche sono state proposte altre strategie: si è pensato di intervenire con approcci terapeutici che comportano la modifica genetica diretta delle cellule del paziente. Si parla, in questo caso, di terapia genica. Un gene che muta può causare innumerevoli conseguenze negative a livello cellulare, compromettendo la funzionalità di tessuti e organi. La mutazione di un enzima, ad esempio, può causare l’accumulo del substrato o la carenza di un composto vitale per la cellula. Se la mutazione colpisce un gene per una proteina strutturale, invece, le cellule, il tessuto e l’organo manifestano anomalie dell’architettura e, di conseguenza, della funzione.

Ad esempio, la fenilchetonuria è una malattia causata dall’accumulo di fenilalanina, dal momento che viene meno l’enzima fenilalanina idrossilasi, il quale, in condizioni fisiologiche, converte la fenilalanina in tirosina. L’accumulo di fenilalanina, a livello del sistema nervoso, causa un anormale sviluppo delle guaine mieliniche: porta a ritardo mentale. Come rimedio, attualmente si interviene con una dieta priva di fenilalanina (alimenti ricchi di questo aminoacido sono le uova, il pesce, il pollo, il manzo, il latte, i legumi ecc.).

Lo scopo della terapia genica, quindi, è quello di prendere un soggetto al quale non funziona un gene e sostituirlo con uno che funziona correttamente, in modo che questo codifichi per una proteina che risolva il problema. Spesso, però, come rimedio per ridurre gli effetti negativi della mutazione genica si limita alla somministrazione della proteina difettiva. Nell’ambito della terapia genica bisogna fare una distinzione di base riguardo al tipo di cellule che vengono modificate: la terapia su cellule germinali produce una modificazione permanente trasmissibile e può essere ottenuta modificando un gamete, lo zigote, o l’embrione in fase molto precoce di sviluppo; la terapia genica su cellule somatiche cerca di modificare specifiche cellule o tessuti di un paziente. Tutti i protocolli e le sperimentazioni di terapia genica attualmente in corso riguardano la terapia genica di cellule somatiche. Per il momento non si può effettuare la terapia genica su cellule germinali, per motivi etici.

Protocolli di terapia genica

• Prova pre-clinica: La terapia genica viene applicata su cellule in vitro e poi sperimentata sugli animali. Successivamente, se né la cellula, né l’animale muore si può andare avanti e iniziare una prima fase clinica.
• Prova di fase I: Avvengono sull’uomo (il numero degli individui è molto stretto: 6-10 persone) e servono per verificare la sicurezza del prodotto. In genere le persone scelte sono i carcerati (se acconsentono), perché gli danno dei permessi di libertà.
• Prove di fase II: La terapia viene testata su un numero più ampio di pazienti per testare l’efficacia del prodotto. Se la cura si mostra efficace, allora si passa alla fase successiva.
• Prova di fase III: La metodica della terapia genica viene testata su un numero enorme di pazienti (quanto più ampio possibile), in varie parti del mondo. Serve per verificare che la terapia non dia effetti collaterali negativi (soprattutto a lungo termine).

Problematiche della terapia genica

• Come accedere alle cellule nelle quali inserire il gene esogeno e correggerlo?
• Bisogna vedere bene dove è localizzata la malattia e in quali organi si esprime.
• Si deve sapere il numero delle cellule che devono acquisire il gene corretto ed esprimerlo in modo da contrastare la malattia: tutte le cellule di un organo devono essere modificate o ne bastano solo alcune?
• Il gene introdotto non deve essere sovraespresso, per non creare problemi fisiologici.
• Le cellule con il gene entrante devono mantenersi indefinitivamente: non deve succedere che la terapia genica duri solo, ad esempio, poche settimane, trascorse le quali il paziente deve essere nuovamente sottoposto a terapia genica.

Tipi di terapia genica

• Terapia genica ex vivo: Si prendono delle cellule dall’organismo che si intende sottoporre alla terapia genica, si mettono in coltura, così da inserirvi il gene correttivo, ed infine si reinseriscono nell’organismo stesso. Questa è la soluzione che solitamente si adatta alle malattie del midollo osseo. Le prospettive della terapia genica ex vivo sono quelle di utilizzare cellule allogeniche transfettate e facilmente coltivabili (come fibroblasti, cheratociti, astrociti, epatociti e mioblasti), che vengono incapsulate con una membrana polimerica semipermeabile artificiale, la quale permetta l’efflusso della proteina ricombinante e l’afflusso dei nutrienti. Tale membrana non immunogena impedisce la risposta immunitaria del paziente e quindi permette al paziente ricevente di tollerare tali cellule. Come materiale di incapsulamento si utilizzano polimeri tra i quali l’alginato-poli-L-lisina-alginato; poli-etere solfone; acrilonitrile-co-cloruro di vinile. Sono state intraprese prove precliniche e di sperimentazione con cellule incapsulate che esprimono il fattore neurotrofico ciliare dell’uomo (CNTF), per evitare la perdita dei neuroni motori, la quale perdita è responsabile della Sclerosi Laterale Amiotrofica (è una malattia degenerativa dei motoneuroni, che causa un graduale irrigidimento di tutta la muscolatura, compresa quella cardiaca e respiratoria).
• Terapia in vivo: Se il paziente è affetto da un melanoma, è possibile inserire all’interno delle cellule tumorali il gene correttivo, in modo da superare la malattia.

Per ottenere l’espressione a lungo termine del gene inserito sarebbe auspicabile integrare il gene terapeutico in un cromosoma della cellula ospite, preferibilmente in una cellula staminale. In questo modo il costrutto verrebbe replicato tutte le volte che la cellule ospite o le sue cellule figlie si dividono. Nel caso della terapia genica ex vivo, questo tipo di approccio è stato provato: si è visto che i risultati, in realtà, non sono stati poi così ottimali. Le cellule staminali che sono state considerate sono le cellule staminali del midollo osseo e le cellule staminali del cordone ombelicale.

Dei geni trasferimento terapeutici

Nel caso della terapia genica ex vivo, dal paziente si preleva il tessuto danneggiato, e se viene prelevato da un luogo diverso dal laboratorio dovrà essere conservato in ghiaccio a 4°C per non più di 72 ore. Il tessuto verrà successivamente lavato in PBS (soluzione tampone) contenente antibiotico e antifungineo. Bisogna trasferire a questo punto il tessuto in una piastra Petri e disgregarlo enzimaticamente (ad esempio, utilizzando tripsina) e meccanicamente. Centrifugare il tessuto in medium caldo e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in medium caldo o PBS e ricentrifugare. Eliminare nuovamente il surnatante. Trasferire il pellet (pezzetti di tessuto) in una piastra Petri e distribuire i pezzi di tessuto in modo da occupare tutta la superficie a disposizione. Aggiungere il volume minimo di terreno di coltura così da coprire tutta la superficie della Petri. Incubare e dopo 2 o 3 giorni le cellule dovrebbero iniziare a migrare dai pezzetti di tessuto e separarsi tra loro. Una volta che le cellule di un tessuto sono state poste in coltura, bisognerà inserire al loro interno il gene di interesse.

Trasferimento per mezzo di virus

Esistono diversi modi per inserire il gene di interesse all’interno di cellule poste in colture (prelevate da un paziente) o all’interno di cellule presenti direttamente all’interno del paziente. Spesso a questo scopo si utilizzano vettori derivanti da virus perché questi, nel corso di milioni di anni di evoluzione, sono diventati efficientissimi nell’infettare le cellule, nell’inserire in esse i loro genomi e nel farvi esprimere i propri geni. Il trasferimento di DNA in cellule umane (o di altri animali) attraverso l’uso di virus è noto come trasduzione. In alcuni casi i vettori virali si possono integrare nel genoma e quindi garantire un’espressione duratura del transgene (inserito precedentemente nel genoma virale al posto di determinati geni strutturali).

Attualmente vengono usati alcuni vettori virali che consentono l’integrazione, ma l’integrazione avviene solitamente in modo casuale o semi-casuale, cosicché gli inserti possono venire a trovarsi in posizioni diverse del genoma nelle diverse cellule del paziente. Ne consegue che i livelli di espressione del costrutto dipendono dal sito cromosomico in cui si integra (positional effect). L’impossibilità di controllare il punto di integrazione dei vettori virali comporta rischi molto elevati, poiché l’integrazione può alterare l’espressione di geni endogeni, portando alla loro inattivazione inserzionale. L’integrazione incontrollata può essere pericolosa anche perché le sequenze promotori/enhancer del DNA ricombinante possono attivare in modo inappropriato i geni che si trovano in prossimità della regione in cui il DNA ricombinante si è integrato.

I sistemi di trasferimento in cui il DNA trasferito si mantiene semplicemente come un episoma extracromosomico nelle cellule non destano lo stesso tipo di preoccupazioni per la sicurezza sollevate dai vettori che si integrano. Il loro svantaggio, però, è la durata limitata dell’espressione genica, poiché, se le cellule bersaglio si dividono attivamente, il gene extracromosomico tenderà a venire diluito man mano che la popolazione cellulare cresce. Questa non costituisce quindi una cura permanente, e può essere necessario effettuare più trattamenti. Questo approccio, però, in alcune applicazioni, come l’eliminazione delle cellule tumorali, non è un problema, poiché in questo caso non è necessaria un’espressione a lungo termine.

Sebbene sussista il problema dell’integrazione casuale quando viene utilizzato come vettore il genoma virale, i virus sono estremamente efficienti nel trasferire geni all’interno delle cellule. Essi si attaccano alle specifiche cellule ospiti, riconoscendo e legando specifiche proteine recettore poste sulla loro superficie. Alcuni virus infettano un ampio spettro di cellule e sono detti ad ampio tropismo, altri invece hanno un tropismo molto ristretto, poiché legano recettori espressi solo su pochi tipi cellulari. Alcuni virus dotati di un involucro, come l’HIV, penetrano nelle cellule fondendosi con la membrana plasmatica della cellula ospite per rilasciare il loro genoma e le proteine del capside nel citosol, ma altri virus dello stesso tipo, una volta legati ai recettori sulla superficie cellulare, innescano un processo di endocitosi recettore-mediata, o un trasferimento basato su fusione o endocitosi.

I retrovirus garantiscono una grande efficienza di trasferimento genico. Poiché si integrano nei cromosomi, è possibile ottenere un’espressione stabile e a lungo termine del transgene, ma l’integrazione incontrollata nei cromosomi costituisce un rischio per la sicurezza per i motivi precedentemente esposti. Come visto per gli animali transgenici, il genoma dei retrovirus è rappresentato da due singoli filamenti di RNA, contenuti in un nucleocapside, a sua volta circondato da un envelope. Dopo che il retrovirus viene riconosciuto da specifici recettori presenti sulla membrana della cellula, il suo envelope si fonde con la membrana stessa. Così il nucleocapside viene rilasciato nella cellula e il suo genoma a RNA viene trascritto a formare DNA a doppia elica. Il genoma dei retrovirus presenta tre importanti geni: gag (codifica per le proteine del nucleocapside); pol (codifica per la proteasi, per la trascrittasi inversa, e per l’integrasi); env (codifica per le proteine dell’envelope, tra cui quelle che legano il recettore delle cellule che verranno infettate). All’estremità 3’ e 5’ sono presenti le cosiddette “lunghe ripetizioni terminali” (LTR). Sul loro genoma è, inoltre, presente il segnale psi, cioè il segnale di incapsidazione, senza del quale le proteine strutturali non possono comporre la struttura entro la quale è contenuto il genoma virale e, di conseguenza, non potrà formarsi la progenie virale.