Tecniche e metodologie analitiche in spettrometria di massa

ELECTROSPRAY IONIZATION (ESI)

È una tecnica di ionizzazione SOFT che avviene in soluzione tramite reazioni acido-

base. Adatto per composti volatili, non volatili, mediamente polari, polari e ionici sia a

basso PM (fino a poche decine di Da) che ad alto PM (fino a circa 105/106 Da). Ioni

multicarica: abbatte la scala di masse dividendola per un numero di cariche

m/z

maggiore di 1, spostando quindi gli ioni in un range di accessibile per la maggior

parte degli analizzatori di massa. Numero di cariche dipende dalle proprietà

acido/base della molecola, dal numero di siti ionizzabili ed è proporzionale alle sue

dimensioni. Ciò è molto importante perché permette di estendere il range effettivo di

analizzatori aventi un range ridotto, quali ad esempio i quadrupoli.

Il campione viene introdotto per infusione in continuo tramite una pompa/siringa senza

separazione (usato per lo studio di miscele semplici o calibrazione esterna), oppure

mediante LC se si tratta di miscele complesse di analiti.

La ionizzazione ESI è in grado di dislocare un numero di cariche molto elevato sulla

molecola, in questo modo aumenta il numero di cariche e si estende il range di

rapporti m/z che possono essere misurati dall'analizzatore di massa.

Per passare dalla soluzione alla fase gas vi sono quattro fasi:

1. In corrispondenza del capillare metallico di nebulizzazione si forma un eccesso

di cariche di solvente a seguito dei processi elettrochimici, che avendo lo stesso

segno favoriscono l'elettro nebulizzazione e ionizzano le molecole in soluzione

2. Si forma un aerosol di goccioline cariche dal capillare di nebulizzazione

3. Riduzione delle goccioline cariche a seguito dell'evaporazione del solvente con

conseguente fissione coulombiana

4. Produzione di ioni in fase gas a partire dalle goccioline cariche

Il processo di nebulizzazione avviene poiché all'uscita del capillare il liquido

(soluzione) è esposto ad un campo elettrico che induce la separazione di carica.

All’uscita del capillare il liquido è esposto ad un campo elettrico di circa 106 V/m. Il

campo elettrico induce la separazione elettroforetica di carica nella soluzione

elettrolitica fino alla deformazione di forma conica del menisco. La migrazione

dell’eccesso di carica positiva verso il controelettrodo è bilanciata dalla tensione

superficiale del liquido con la deformazione del menisco  formazione del cono di

Taylor. Modalità ioni positivi; i cationi si allontanano dalla superficie del capillare, verso

 l’interno, concentrandosi sulla punta in corrispondenza del menisco e tendono a

migrare verso il controelettrodo, gli anioni migrano verso la superficie del

capillare, lontano dalla punta

Modalità ioni negativi accade l'esatto opposto, ovvero i cationi migrano verso la

 superficie del capillare mentre gli anioni si concentrano sulla punta della siringa

di iniezione

Se il voltaggio applicato è sufficientemente elevato, la tensione superficiale è superata

dalle forze di repulsione elettrostatica e si ha rilascio dello spray di goccioline cariche.

Il potenziale applicato non deve essere nemmeno troppo alto altrimenti spray instabile

e diminuzione di sensibilità.

Le dimensioni delle goccioline dipendono da diversi fattori:

Flusso della soluzione

 Diametro del capillare

 Caratteristiche del solvente

 Potenziale applicato

 Tensione superficiale e tensione di vapore



L’ottimizzazione di tutto porta ad un buon segnale. ESI dipende tantissimo da una

serie di parametri che necessitano uno studio. Invece la ionizzazione elettronica è

molto standardizzata, serve poco intervento per migliorare il segnale. Questo è un

problema multivariato, sia come fattori singoli che con interazioni. La sorgente è molto

delicata ed è una fase critica la scelta dei parametri di ionizzazione (tuning sorgente).

Ad alti flussi, come LC, spesso non basta il potenziale di elettronebulizzazione (decine

di kV), quindi si passa ad un assitenza pneumatica, dove coassiale al flusso di uscita si

fa flussare azoto per favorirne l’elettronebulizzazione. Così si possono usare flussi nel

range UPLC, 700 microL/min, aumenta anche la percentuale di acqua aggiunta

all’interno della fase mobile: tensione superficiale molto alta, favorisce la

nebulizzazione.

Nel processo di elettronebulizzazione assistita pneumaticamente (per flussi LC: intorno

ai 200 μl/min), all’azione del campo elettrico, si aggiunge quella di un flusso di gas

sheat-gas,

coassiale di un gas inerte (N2), chiamato intorno al capillare di

nebulizzazione. In questo modo si possono usare flussi più elevati e una percentuale

maggiore di acqua. ESI pneumatico: ad aumento del flusso perdo l’efficienza della

ionizzazione, resta però sufficiente/buona anche ad alti flussi.

Per favorire la nebulizzazione e la desolvatazione delle goccioline cariche si può usare

un auxiliary gas/desolvation gas, che può anche essere scaldato, coassiale al flusso

ma più esterno rispetto a quello di nebulizzazione. Evaporazione del solvente dalle

goccioline cariche originate dal cono di Taylor (ø: 1-2 μm) con forte eccesso di cariche

dello stesso segno (nell’ordine delle 104 cariche) aumenta densità di carica



Sono formate le goccioline con eccesso di carica sulla superficie, il loro movimento dal

probe fino all’orifizio di entrata subiscono l’evaporazione del solvente, dove le

goccioline diventano sempre più piccole. Il processo di desolvatazione può essere

favorito riscaldando la sorgente e con un flusso di gas in aggiunta a quello che assiste

l’elettronebulizzazione, ancora coassiale al flusso del campione ma in un capillare più

esterno. Questo flusso di gas può essere riscaldato (l’analita non risente della

temperatura, è ancora okay per molecole termolabili). A questo punto si va ad

aumentare la densità di carica, dovuta all’evaporazione del solvente fino al limite di

Rayleigh. Una volta raggiunto il limite di RAYLEIGH (repulsione elettrostatica

> tensione superficiale) le goccioline si disintegrano formando gocce sempre più

piccole mano a mano che il solvente evapora, determinando la formazione di ioni in

fase gas. Avviene una fissione coulombiana, dove la gocciolina esplode a dare

goccioline ancora più piccole, circo 1/2% della dimensione con più carica rispetto alle

goccioline iniziali. Non è ancora una ione in fase gas. Non è che la gocciolina con

eccesso di carica esplode in modo simmetrico/omogeneo a dare goccioline piccole, in

realtà è una fissione disomogenea a dare un allungamento prima e poi perde delle

goccioline dalla coda formatasi. In realtà, probabilmente le goccioline non esplodono

ma emettono le goccioline più piccole (circa una ventina) da un ramo allungato

(fissione a getto, droplet jet fission) uneven fission. Questo perché probabilmente



durante il volo la goccia si deforma e quindi non hanno perfetta simmetria sferica.

Usato anche un flusso di gas controcorrente (curtain gas/ sweep gas/cone gas)

efficace desolvatazione degli ioni, rottura di eventuali cluster con solvente, inoltre

permette di evitare l’ingresso di specie neutre, riducendo quindi la contaminazione.

Il processo di ionizzazione non ionizza tutto l’analita ma c’è una sorta di

proporzionalità tra la concentrazione dell’analita e l’intensità del segnale che si

ottiene. Non tutte le goccioline che si formano sono efficacemente desolvatate per

dare lo ione in fase gas. Per questo è importantissimo la dimensione piccola delle

goccioline per aumentare l’efficacia della desolvatazione. Sono importantissime le

caratteristiche del solvente. Una parte di goccioline restano in parte desolvatate a

dare cluster tra solvente-solvente, ione-solvente. È quindi molto importante

mantenere pulito l’orifizio di entrata e tutta l’ottica della zona del pre vuoto per evitare

depositi ed anche per ridurre il rumore. Si vuole allontanare le specie neutre non

ionizzate ed anche terminare la desolvatazione delle goccioline nella zona tra ESI

probe ed orifizio di entrata, rompere eventuali cluster. Esistono accorgimenti integrati

nella interfaccia API per gestire questi aspetti, uno di questi è l’utilizzo di un gas contro

corrente (ha vari nomi in base allo strumento). È sempre azoto flussato contro corrente

rispetto al flusso degli ioni. Quindi nella maggior parte dei casi entrano solo ioni in fase

gas, si limita anche l’introduzione di goccioline non sufficientemente desolvatate. Altro

punto è che molto spesso questo flusso contro corrente o perpendicolare rispetto alla

direzione degli ioni serve per rompere i cluster ionici solvente analita. I cluster

complicano lo spettro di massa come interpretazione ed anche perché l’analita con un

solo segnale ho una certa intensità, se invece l’analita da una varietà di segnali

(addotti, cluster …) perderei l’intensità di segnala di ogni singola specie. Posso anche

utilizzare in certe configurazioni una transfer tube.

Gli ioni in fase gas si formano mediante due meccanismi diversi:

Charge residue model (CRM); per molecole più grandi si procede finché le

 goccioline ottenute contengono una singola molecola di Annalisa e in seguito

alla desolvatazione si ottiene lo ione In fase gas

Ion evaporation model (IEM); Ioni di dimensioni più piccole si arriva al punto in

 cui lo ione In fase gas evapora dalla goccia.

Per un efficace desolvatazione degli ioni si utilizza un flusso di gas controcorrente

oppure una transfer tube di metallo di metallo riscaldato. Le molecole più piccole

formeranno ioni monocarica mentre le molecole di dimensioni maggiori daranno

origine a ioni multicarica.

Prime sorgenti API: geometria assiale, ora buona parte sono ortogonali. Solo ioni e non

molecole neutre entrano dall’orifizio, che può essere più largo, cosa che, insieme a

riduzione del rumore, compensa la perdita di trasmissione dovuti a questa geometria.

La sorgente può avere diverse geometrie oltre a quella in cui il capillare e l'orefizio di

entrata sono allineati in modo da ridurre le contaminazioni da altri

composti. Solitamente la frammentazione avviene nella zona di vuoto, ma è possibile

che ci sia frammentazione anche nella zona di pre-vuoto e in questo caso si parla di in-

source fragmentation.

L'ESI viene generalmente eseguita con soluzioni contenenti alcune specie ioniche,

necessarie per garantire una certa conducibilità, ottenere uno spray stabile, favorire la

separazione di carica alla punta del capillare e ionizzare le molecole neutre. Queste

specie possono essere l'analita ionico, impurità del solvente, elettroliti aggiu