Tecniche calorimetriche per i nanosistemi

∆H

abbiamo una distanza che corrisponde al di reazione; tramite la pendenza si ricava la costate

di legame; e siccome ho in siringa una specie a concentrazione nota, ho il rapporto tra legante e

recettore, quindi posso riportare il rapporto molecolare. Questo mi permette di stabilire, sempre al

punto di flesso, la stechiometria e cioè quante molecole di ligando servono per saturare la

macromolecola.

La costante fornisce la pendenza riportando

sulle ascisse il numero di siti interessati al

processo.

Va sempre bene la ITC? No, ci vogliono le

condizioni ottimali, cioè la curva deve essere

ripida. La ripidità della curva è data da un

certo valore C (Kd = costante di

dissociazione).

Per rendere la curva più ripida posso lavorare

sulla concentrazione della macromolecola, per

avere un valore ottimale di C = 5-500. Dopodiché l’energia libera del processo è data

da -RTlnK.

C’è una formula che lega l’energia libera e la

costante di equilibrio. La costante di

associazione è l’inverso della costante di

dissociazione. ∆H

L’energia libera a sua volta dipende dal che

misuro, dalla T che misuro, e conoscendo K

dalla pendenza del profilo, arrivo a determinare

tutto, anche l’entropia. Ho molte info sul

sistema, praticamente tutto.

Si vede che c’è una costante di Binding alta, ma

∆H

non esagerata, un di transizione di 26

∆S

kcal/mol ed un di 47,5 unità entropiche.

Quello che potrebbe sembrare strano è n = 1,42 (potrebbe risultare strano perché o c’è un sito o

ce ne sono due, ma il numero è intermedio), significa che, oltre ad essere un valore statistico,

questo processo avviene attraverso più stadi: una volta è coinvolto un sito di legame solo, e in un

altro due.

Uno immagina un meccanismo di legame complesso che è facile da trovare nelle macromolecole.

( se si misura la pendenza positiva si valuta la costante di associazione, se si trova una costante

minore di 1 è di dissociazione)

CONTRIBUTO ENTALPICO ED ENTROPICO

ENTALPIA

È dovuta alla formazione o rottura di legami:

- legami ad idrogeno

- Protonazione

- Legami specifici

ENTROPIA

È dovuta:

- Interazioni idrofobiche

- Rilascio di H20

- Rilascio di ioni

- Cambio conformazionale. ∆G

Quindi quando l’entropia aumenta (∆S > 0) il diminuisce

Questo ci aiuta a valutare sistemi complessi come ad esempio la complessazione del DNA.

Il DNA ha ioni sodio legati ai gruppi fosfato e quando si complessa per preparare un aggregato

questi ioni vengono rilasciati ed aumentano l’entropia, favorendo la formazione del complesso.

nell’immagine abbiamo 3 processi che avvengono con la

stessa Binding Energy, con la stessa energia libera

(rossa – costante).

Nel primo processo (A) c’è una forte variazione di

entalpia, abbassamento, quindi il sistema forma i legami

e Libera questa energia. Con la stessa energia libera il

meccanismo può essere diverso a seconda di quanto

pesano questi due contributi.

Uno strumento di questo genere ha un costo elevato, soprattutto per quanto riguarda la siringa;

però si ottengono informazioni importanti sul sistema in esame.

Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in biotechnology

In biotecnologie la maggior parte delle reazioni biochimiche determinano piccoli cambi di calore e

questi si possono misurare con ITC.

Questa tecnica ITC presenta alcuni vantaggi ed altri svantaggi.

VANTAGGI:

● IL calore di reazione si misura subito quindi non c’è bisogno di usare marcature che

cambiano in qualche modo la macromolecola. Non è detto che sul sito attivo i marcatori

siano innocui. La tecnica è non invasiva. Le macromolecole sono prodotti costosi per cui

posso fare la misura e poi riusarle.

● Si misurano calori direttamente quindi non si usano queste reazioni

che i chimici hanno usato, ovvero l’equazione di Van’t Hoff, la

quale era molto usata, ma bisognava misurare una variazione di

energia libera dividerla per T e calcolarla in funzione della temperatura; processo che non

era sempre agevole.

LIMITAZIONI:

● 2 ml di una concentrazione micromolecolare possono essere tanti, quindi si tende ad usare

delle micro-ITC che lavorano con un decimo di questa grandezza. Costano un po’ di più

ed il risultato è un po’ più affetto da rumore ma non ci sono problemi.

● Il limite maggiore riguarda la caratteristiche del sistema, perché il calore ci vuole, l’affinità

ci deve essere, altrimenti non si riesce a rilevare differenze. Si può avere un processo

∆H,

senza ma senza questo non si arriva da nessuna parte, magari il processo è

∆H

spontaneo ma senza non avviene. Se ho un processo atermico questo metodo non è

usabile.

ESEMPIO: legame tra sinaptotagmina e ioni Ca

Le sinapsi sono strutture implicate nella comunicazione tra cellule. Possono essere elettriche o

chimiche a seconda dei meccanismi. A noi però interessa la formazione / rottura di un legame.

Abbiamo questa grande proteina attivata da ioni Ca, ma siccome la proteina è grande non

bisogna metterla tutta in soluzione ma si può mettere anche solo la porzione attiva e quindi

mettiamo il dominio C2A in soluzione con gli ioni calcio.si scoprono certi andamenti e in

particolare si riesce a vedere che ci sono 2 siti attivati a T diversa:

- a 37 °C viene attivato anche il secondo sito

- Inoltre per il sito N1 si vede che a T > il processo di Binding diventa via via meno esotermico

quindi meno forte. Quindi all’aumentare della T il sito N1 lega il ligando con energia minore.

CALORIMETRIA A SCANSIONE DIFFERENZIALE DSC

Adesso facciamo una scansione e compensiamo.

Misuro le differenze tra campione e riferimento inerte al variare di T.

Che cosa si misura?

● Calori di reazione: nella DSC ci sono dei piccoli “pun” di alluminio in cui facciamo avvenire

una reazione (di solito sono reazioni semplici come di disidratazione).

● Stabilità termica di un materiale: se faccio la scansione di T e vedo un picco so che il

materiale è cambiato, normalmente si degrada. Quindi per la stabilità termica dei materiali

è una tecnica semplice e poco costosa.

● Transizione di fase.

● Cinetiche di reazioni: se vi facciamo avvenire la reazione.

● Composizione e Purezza di un sistema: questo è importante perché con un sistema meno

puro il punto di fusione cambia tantissimo.

● Diagramma di fase (per il passaggio da uno stato all’altro).

Sistemi tipici da studiare con la tecnica DSC sono proprio i polimeri.

STRUMENTAZIONE

Anche qui si hanno due comparti, uno dove c’è il

campione ed uno dove c’è il riferimento; ognuno ha

la sua termocoppia e quando avviene un evento che

libera o assorbe calore bisogna compensare sempre

basandosi sull'effetto Joule (per via elettrica).

Bisogna essere sicuri di non aver interferenze; il

riferimento deve essere un metallo inerte.

Ci sono dei pun adatti anche per i liquidi quindi si

fanno esperimenti anche per i liquidi, anche se l’uso

principale riguarda le sostanze solide.

La relazione che si usa è definita da:

- moli di prodotti formatosi

- Capacità termica

Se il processo è endotermico il processo assorbe calore e la

sua T diventa più alta di quella del riferimento.

Termogramma

Per convezione i picchi esotermici si riportano verso l’alto e

quelli endotermici verso il basso.

L’area del picco è legata all’entalpia quindi la DSC è una tecnica quantitativa perché se conosco

la Capacità termica di un certo polimero, dall’area del picco posso determinare quanto ne ho; e la

linea di base è molto importante perché è legata alla capacità termica.

Le aree dei picchi dipendono da:

● Quantità di campione.

● Calore di reazione.

Conoscendo una di queste grandezze ci si può ricavare l’altra usando la relazione:

Questa comprende diverse costanti:

● m = quantità di campione.

● g = costante dipendente dall’impaccamento del campione.

● c = costante dipendente dalla conducibilità termica del campione.

Le due costanti g e c si possono combinare in un'unica costante “c’ “ abbiamo l’area che dipende

dalla massa e dall’entalpia. Conoscendo la massa si ricava l’entalpia; viceversa se il campione è

∆H

noto ed in miscela conoscendo il si usa come tecnica analitica per sapere quale quantità di

campione abbiamo.

La forma del termogramma dipende dalla velocità di scansione,

quindi questa deve essere abbastanza lenta.

Per esempio: Questi due termogrammi sono lo stesso ma nel caso A

è fatto a 2 °C al minuto, nel B a 10 °C al minuto.

Se faccio una scansione troppo veloce rischio di perdere dei picchi.

(l’immagine mostra una scansione di una soluzione contenente

ESTRADIOLO EMIIDRATO)

STUDIO DEI POLIMERI

Si possono ottenere diverse info. Quasi tutti i polimeri hanno una componente vetrosa, cioè

disordinata ed amorfa, e una cristallina. Siccome ci sono diversi picchi ci sono dei database dei

materiali dove addirittura si possono avere informazioni sul modo di produzione, perché se un

picco manca vuol dire che quel determinato processo nella produzione del polimero non è stato

fatto, quindi serve anche per determinare la qualità delle plastiche.

Inoltre se vedo una decomposizione a 150°C vuol dire che a quella T non posso usare il polimero

perché si decompone quindi DSC dà indicazioni sulla T massima di utilizzo.

La transizione vetrosa è un picco larghissimo, si riconosce

perché è quasi solo una variazione di una linea di base.

Se ho una miscela, quindi più fasi coesistenti allo stato

solido, l’area del picco dipende anche dall’estensione della

fase.

Se ho una fase estesa per 868 nm ottengo un picco definito

(come quello in alto nell'immagine sottostante), se ho dei

domini più piccoli ottengo dei picchi peggio definiti.

Bisogna sempre dire se stiamo parlando della prima scansione oppure se facciamo l’Annealing e

poi la scansione del sistema.

Una cosa che ci riguarda sono i termogrammi degli strati lipidici. Il fatto che esistano catene

mobili e catene rigide nello stato liquido-cristallino è venuto fuori proprio da studi in DSC, la quale

ha permesso di stabilire che all’interno degli strati le catene potevano essere fluide o impaccate

più regolarmente.

Il fatto che nell’immagine a fianco vi siano due picchi vuol dire che c’è stato prima un

riarrangiamento e po