Riassunto esame Citologia e istologia, Prof. Bacci Stefano, libro consigliato Manuale di citologia e istologia , Stefano Bacci

ALTRI MICROSCOPI

•INVERTITO: Ha la sorgente di luce e il Condensatore sopra il tavolino portaoggetti e gli

obiettivi sotto

È usato per lo studio di cellule in coltura e nelle tecniche di micromanipolazione.

•CONTRASTO DI FASE: permette di vedere cellule in coltura senza l’uso di coloranti e

fissativi. Pone diaframma di fase nel condensatore che lascia passare la luce in una corona

circolare , che darà come risultato un fascio di luce conico e cavo. Si ha la lamina di fase nel

piano focale dell’obiettivo, in modo che raggi trasmessi passano nel vetro sottile e quelli

diffrazione in quello spesso, i due raggi vengono così ricongiunti dando vita all’immagine.

Utilizza obiettivi speciali (Ph).

•CAMPO SCURO:molecola cellule prive di pigmenti non si vedono in campo chiaro per la

scarsa differenza di contrasto. Il campo oscuro si ottiene ponendo un diaframma sotto il

condensatore, si crea così un cono di luce cavo che colpisce il preparato con luce diffusa,

risulterà su sfondo nero. Evita l'uso di coloranti e fissativi.

•POLARIZZATORE: sono presenti due prismi di Nicols, un posto sotto il condensatore detto

polarizzatore, l'altro posto tra obiettivo e oculare detto analizzatore. Se incrociamo i reticoli

cristallini dei due otteniamo un immagine nera. Un campione monorifrangente risulterà

scuro, strutture birifrangenti scindono il raggio in uno ordinato e uno straordinario, la

vibrazione di quello straordinario è ruotata a 90° per cui passa dall'analizzatore e apparirà

luminosa. Ruotando bene l'analizzatore rispetto al polarizzatore abbiamo la massima

luminosità.

-sostanze isotrope (vetro) sono composte da molecole ordinate

-sostanze anisotrope (cristalli) hanno struttura ordinata periodica.

•A FLUORESCENZA: il campione è solitamente composto da cellule, batteri, tessuti,

contiene il fluoroforo che viene colpito ed eccitato da luce ultravioletta o laser ed Emette così

luce. Il preparato è eccitato grazie allo specchio dicroico. La luce prima di arrivare all’oculare

viene fermata da uno sbarramento così all’occhio arrivano solo raggi emessi per

fluorescenza.

•CONFOCALE: usa una sorgente laser che per la presenza di un sistema ottico ed

elettronico scansiona ricostruisce su schermo una sezione del campione. Usa due pinhole,

due piccoli fori confocali.

Alternativi:

-Deconvoluzione: usa metodi matematici di convoluzione

-Multiphoton Imaging: non ha fenditura al rivelatore visto che il laser eccita il fluorocromo nel

punto di fuoco.

•A 2 FOTONI: Usa laser per eccitare molecole fluorescenti di un campione e rilevatori per

misurare la luce emessa. Sfruttano l’Assorbimento simultaneo di due fotoni nell’infrarosso

con vantaggi:

-Le lunghezze d’onda usate sono meno tossiche per le cellule e sono più penetranti

-L’eccitazione del fluoroforo viene fatta nel piano focale dove la luce è più concentrata

riducendo la luce fuori fuoco, aumenta la qualità.

•ELETTRONICO A TRASMISSIONE: gli elettroni emessi dal filamento sono accelerate dalla

differenza di potenziale tra catodo e andò generata da sistema ad alta tensione. Il fascio

elettronico è concentrato dalla lente elettromagnetica. Le lenti obiettivo e intermedia

ingrandiscono l'immagine, la lente protettiva la ingrandisce ulteriormente. La colonna è

tenuta sotto vuoto spinto da un sistema di pompe.

•ELETTRONICO A SCANSIONE: sfrutta il fascio elettronico ad alta energia nel vuoto, esso

viene focalizzato da un sistema di lenti deflesso per scandire l'area del campione.

L'interazione fascio-campione genera segnali acquisiti da detectors ed elaborati in un

immagine a livelli di grigio.

•A FORZA ATOMICA: usano una risoluzione sub-nanometrica che registra le interazioni tra

superficie e una punta montata all’estremità di una microleva. Fornisce informazioni spaziali,

perpendicolari e parallele alla superficie, dando un immagine 3D, investigano proprietà

meccaniche locali del campione attraverso l’interazione punta-campione.

•AD ALTA RISOLUZIONE: usa la STED che da immagini con dettaglio inferiore a 100 nm.

Grazie a questa si è potuto vedere le particelle dell’epatite B.

STUDIO

Avviene sotto cappa per laboratorio con il microtomo (manuale/motorizzato,rotativo/a slitta)

che permette di tagliare con lama di acciaio sezioni di 4-6 microm= sezioni paraffina che

vengono stese su un vetrino portaoggetto, colorate e chiuse in un vetrino coprioggetto.

Tappe:

•Fissazione: trattamento che stabilizza la biopsia per bloccare le alterazioni postmortali. Il

fissato più usato è l’aldeide formica,si trova in commercio in soluzione acquosa al 40% nota

come formalina.

•Sezione: rende il preparato attraversabile da luce o elettroni, si divide in:

-Disidratazione

-Diafarizzazione: usa xilene per rendere trasparente il campione

-Inclusione: unisce campione a paraffina

-Dissezione: forma blocchetti con il microtomo.

•Colorazione: trattamento con sostanze colorate o opache agli elettroni che differenzia le

varie strutture, i coloranti possono essere:

-Acidi: la parte che si attacca al tessuto e da colore è l’anione, acidofilia è l’affinità per tali

coloranti.

-Basici: la parte che si attacca al tessuto e da colore è il catione,basofilia è l’affinità per tali

coloranti.

Sono in genere usati ematossilina ed eosina che fanno apparire il nucleo (basofilo) blu-viola

e il citoplasma (acidofilo) rosa.

Sono inutili le impregnazioni che utilizzano sali metallici che precipitano solo in alcune zone

La colorazione dipende da:

-Affinità chimica tra tessuti e coloranti

-Concentrazione costituenti

-Permeabilità

COLORANTI:

•Ematossilina: sostanza incolore estratta dal legno, colora quando ossida in emateina con

l'aggiunta del modernizzante. Il composto colora progressivamente, è detto lacca alluminica

o ferrica.

•Eosina: è uno xantenico acido basofilo. Si usa una soluzione madre all’ 1% diluita con

acqua distillata fino ad avere riflessi fluorescenti sul menisco , si aggiunge così CH3COOH

Per mantenere antigenicità posso operare a freddo: il campione viene immerso nel freon e

congelato in azoto liquido, raggiunge fino a -100°C, viene dissezionato, creata una replica

metallica ed esaminata al TEM.

METODI

•IMPREGNAZIONE ARGENTICA: Crea contrasto tra le parti del preparato grazie alle

impregnazioni che utilizzano sali metallici che precipitano solo in alcune zone.

Argirofilia indica l'affinità di un substrato organico a legare sali d'argento. Se dopo il legame il

preparato è trattato con sali riducenti da questi si libera argento metallico nero che evidenzia

le fibre.

Golgi ideò un metodo per visionare i neuroni in preparati fissati con bicromato di potassio,

impregnati con nitrato d'argento.

Nel metodo Cajal i frammenti di tessuto dopo fissazione sono impregnati con soluzione di

nitrato d'argento e trattati con agenti chelanti riducenti. Colora neurofibrille e rende visibili

dettagli fini (ramificazioni terminali).

•LIPIDI: vengono estratti dalle cellule, si usano sezioni istologiche congelate ottenute con

criostato o microtomo congelatore, i lipidi vengono evidenziati con coloranti liposolubili.

•GLUCIDI: La PAS evidenzia i polisaccaridi neutri. Gli ossidrili sono ossidati dell'acido

periodico formando gruppi aldeidici. Il reattivo Schiff vira colore in rosso magenta.

•METACROMASIA: Fenomeno per cui i tessuti prendono colore diverso da quello del

colorante Blu di toluidina. Si ha quando sostanze come proteoglicani a seconda della

disposizione e numero di radicali anionici posti sul contorno delle molecole

Quando i radicali sono rarefatti e il colorante rado la colorazione è ortocromatica=blu,

quando i radicali sono numerosi e ravvicinati il colore diviene violetto.

•ACIDI NUCLEICI: il DNA lega col reattivo di Schiff colorando dopo l'idrolisi acida fatta con

acido cloridrico, questa separa basi azotate e lo zucchero il cui gruppo aldeidico reagisce col

reattivo di Schiff.

Sostanze fluorescenti colorano DNA legandosi a Tiamina-Adenina (DAPI), o a

Citosina-Guanina (CAM3).

CITOCHIMICA DI AFFINITÀ

Tecniche che sfruttano Il legame tra ligando e sito di legame per dimostrare quest'ultimo:

•Ligando:molecola estranea ad un compartimento della materia vivente capace di legarsi a

una molecola di tale compartimento.

•Sito di legame: molecola di un compartimento della materia vivente capace di legarsi a un

ligando.

•Recettore: sito di legame che legando col ligando causa la cascata segnalatoria che

modifica il compartimento in cui esso si trova.

L'unione ligando e sito è garantita da legami deboli , efficaci in quanto numerosi e congruenti

tra loro.

Proteine vegetali della famiglia delle lecitine legano a pacifici residui zuccherini, ciò ha

incrementato lo studio di polisaccaridi, membrana cellulare, compartimenti interni e

meccanismi (Adesione, riconoscimento cellulare). Sono usate lecitine coniugate con

opportuni marcatori che permettono la localizzazione di glicoproteine in superficie.

IMMUNOISTOCHIMICA

È la branca dell'istochimica che analizza le reazioni tra antigene e anticorpo.

•Antigene: è una sostanza estranea all'organismo caratterizzata da uno o più epitopi, ovvero

siti specifici che nel caso di antigeni proteici sono rappresentati da segmenti di decine di

amminoacidi.

-Policlonale: da coniglio, si dirige verso vari epitopi

-Monoclonale: da topo, si dirige verso il singolo epitopo

•Anticorpo: ha forma a Y , composto da 4 catene proteiche, due leggere e due pesanti unite

da ponti disolfuro. Hanno una parte che si lega all'aptene variabile formata da catena

pesante e leggera, e l'altra costante formata da catene pesanti.

Il legame antigene anticorpo si ha con legami deboli e numerosi.

Con anticorpi marcati con sostanze fluorescenti si può evidenziare particolari antigeni nelle

cellule.

METODI:

•Diretto: usa anticorpi primari marcati con colorante fluorescente. Il sito di legame ha

intensità molto bassa visibile al microscopio a fluorescenza

•Indiretto: lega agli anticorpi primari uno o più anticorpi secondari marcati con colorante

fluorescente, così il segnale fluorescente è forte e visibile.

IBRIDAZIONE IN SITU

Localizza sequenze di DNA o RNA su cellule o tessuti. L'ibridazione in situ si basa sulle

sequenze nucleotidiche complementari che si appaiano tra loro in particolari condizioni

sperimentali, la marcatura di una delle due sequenze localizza la sequenza bersaglio a cui si

appaia.

ANALISI DI IMMAGINE

Partendo da un'immagine simile a quella ricreata