Riassunto esame Citologia e istologia, Prof. Bacci Stefano, libro consigliato Manuale di citologia e istologia , Stefano Bacci

Altri microscopi

Invertito

Ha la sorgente di luce e il condensatore sopra il tavolino portaoggetti e gli obiettivi sotto. È usato per lo studio di cellule in coltura e nelle tecniche di micromanipolazione.

Contrasto di fase

Permette di vedere cellule in coltura senza l’uso di coloranti e fissativi. Pone diaframma di fase nel condensatore che lascia passare la luce in una corona circolare, che darà come risultato un fascio di luce conico e cavo. Si ha la lamina di fase nel piano focale dell’obiettivo, in modo che raggi trasmessi passano nel vetro sottile e quelli diffrazione in quello spesso, i due raggi vengono così ricongiunti dando vita all’immagine. Utilizza obiettivi speciali (Ph).

Campo scuro

Molecole o cellule prive di pigmenti non si vedono in campo chiaro per la scarsa differenza di contrasto. Il campo oscuro si ottiene ponendo un diaframma sotto il condensatore, si crea così un cono di luce cavo che colpisce il preparato con luce diffusa, risultando su sfondo nero. Evita l'uso di coloranti e fissativi.

Polarizzatore

Sono presenti due prismi di Nicols, un posto sotto il condensatore detto polarizzatore, l'altro posto tra obiettivo e oculare detto analizzatore. Se incrociamo i reticoli cristallini dei due otteniamo un'immagine nera. Un campione monorifrangente risulterà scuro, strutture birifrangenti scindono il raggio in uno ordinato e uno straordinario; la vibrazione di quello straordinario è ruotata a 90°, per cui passa dall'analizzatore e apparirà luminosa. Ruotando bene l'analizzatore rispetto al polarizzatore si ottiene la massima luminosità.

• Sostanze isotrope (vetro) sono composte da molecole ordinate.
• Sostanze anisotrope (cristalli) hanno struttura ordinata periodica.

A fluorescenza

Il campione è solitamente composto da cellule, batteri, tessuti, contiene il fluoroforo che viene colpito ed eccitato da luce ultravioletta o laser ed emette così luce. Il preparato è eccitato grazie allo specchio dicroico. La luce, prima di arrivare all’oculare, viene fermata da uno sbarramento, così all’occhio arrivano solo raggi emessi per fluorescenza.

Confocale

Usa una sorgente laser che, per la presenza di un sistema ottico ed elettronico, scansiona e ricostruisce su schermo una sezione del campione. Usa due pinhole, due piccoli fori confocali.

Alternativi

• Deconvoluzione: usa metodi matematici di convoluzione.
• Multiphoton Imaging: non ha fenditura al rivelatore visto che il laser eccita il fluorocromo nel punto di fuoco.

A 2 fotoni

Usa laser per eccitare molecole fluorescenti di un campione e rilevatori per misurare la luce emessa. Sfrutta l’assorbimento simultaneo di due fotoni nell’infrarosso con vantaggi:

• Le lunghezze d’onda usate sono meno tossiche per le cellule e sono più penetranti.
• L’eccitazione del fluoroforo viene fatta nel piano focale, dove la luce è più concentrata, riducendo la luce fuori fuoco, migliorando la qualità.

Elettronico a trasmissione

Gli elettroni emessi dal filamento sono accelerati dalla differenza di potenziale tra catodo e anodo generata da sistema ad alta tensione. Il fascio elettronico è concentrato dalla lente elettromagnetica. Le lenti obiettivo e intermedia ingrandiscono l'immagine, la lente protettiva la ingrandisce ulteriormente. La colonna è tenuta sotto vuoto spinto da un sistema di pompe.

Elettronico a scansione

Sfrutta il fascio elettronico ad alta energia nel vuoto, esso viene focalizzato da un sistema di lenti deflesso per scandire l'area del campione. L'interazione fascio-campione genera segnali acquisiti da detectors ed elaborati in un'immagine a livelli di grigio.

A forza atomica

Usano una risoluzione sub-nanometrica che registra le interazioni tra superficie e una punta montata all’estremità di una microleva. Fornisce informazioni spaziali, perpendicolari e parallele alla superficie, dando un'immagine 3D, investigano proprietà meccaniche locali del campione attraverso l’interazione punta-campione.

Ad alta risoluzione

Usa la STED che dà immagini con dettaglio inferiore a 100 nm. Grazie a questa si è potuto osservare le particelle dell’epatite B.

Studio

Avviene sotto cappa per laboratorio con il microtomo (manuale/motorizzato, rotativo/a slitta) che permette di tagliare con lama di acciaio sezioni di 4-6 micrometri= sezioni paraffina che vengono stese su un vetrino portaoggetto, colorate e chiuse in un vetrino coprioggetto.

Tappe

• Fissazione: trattamento che stabilizza la biopsia per bloccare le alterazioni postmortali. Il fissato più usato è l’aldeide formica, si trova in commercio in soluzione acquosa al 40% nota come formalina.
• Sezione: rende il preparato attraversabile da luce o elettroni, si divide in:
  • Disidratazione
  • Diafarizzazione: usa xilene per rendere trasparente il campione
  • Inclusione: unisce campione a paraffina
  • Dissezione: forma blocchetti con il microtomo.
• Colorazione: trattamento con sostanze colorate o opache agli elettroni che differenzia le varie strutture, i coloranti possono essere:
  • Acidi: la parte che si attacca al tessuto e dà colore è l’anione, acidofilia è l’affinità per tali coloranti.
  • Basici: la parte che si attacca al tessuto e dà colore è il catione, basofilia è l’affinità per tali coloranti.
  Sono in genere usati ematossilina ed eosina che fanno apparire il nucleo (basofilo) blu-viola e il citoplasma (acidofilo) rosa. Sono inutili le impregnazioni che utilizzano sali metallici che precipitano solo in alcune zone. La colorazione dipende da:
  • Affinità chimica tra tessuti e coloranti
  • Concentrazione costituenti
  • Permeabilità

Coloranti

• Ematossilina: sostanza incolore estratta dal legno, colora quando ossida in emateina con l'aggiunta del modernizzante. Il composto colora progressivamente, è detto lacca alluminica o ferrica.
• Eosina: è uno xantenico acido basofilo. Si usa una soluzione madre all’1% diluita con acqua distillata fino ad avere riflessi fluorescenti sul menisco, si aggiunge così CH₃COOH.

Per mantenere antigenicità posso operare a freddo: il campione viene immerso nel freon e congelato in azoto liquido, raggiunge fino a -100°C, viene dissezionato, creata una replica metallica ed esaminata al TEM.

Metodi

Impregnazione argentica

Crea contrasto tra le parti del preparato grazie alle impregnazioni che utilizzano sali metallici che precipitano solo in alcune zone. Argirofilia indica l'affinità di un substrato organico a legare sali d'argento. Se dopo il legame il preparato è trattato con sali riducenti da questi si libera argento metallico nero che evidenzia le fibre.

Golgi ideò un metodo per visionare i neuroni in preparati fissati con bicromato di potassio, impregnati con nitrato d'argento. Nel metodo Cajal i frammenti di tessuto dopo fissazione sono impregnati con soluzione di nitrato d'argento e trattati con agenti chelanti riducenti. Colora neurofibrille e rende visibili dettagli fini (ramificazioni terminali).

Lipidi

Vengono estratti dalle cellule, si usano sezioni istologiche congelate ottenute con criostato o microtomo congelatore, i lipidi vengono evidenziati con coloranti liposolubili.

Glucidi

La PAS evidenzia i polisaccaridi neutri. Gli ossidrili sono ossidati dall'acido periodico formando gruppi aldeidici. Il reattivo Schiff vira colore in rosso magenta.

Metacromasia

Fenomeno per cui i tessuti prendono colore diverso da quello del colorante Blu di toluidina. Si ha quando sostanze come proteoglicani a seconda della disposizione e numero di radicali anionici posti sul contorno delle molecole. Quando i radicali sono rarefatti e il colorante rado la colorazione è ortocromatica=blu, quando i radicali sono numerosi e ravvicinati il colore diviene violetto.

Acidi nucleici

Il DNA lega col reattivo di Schiff colorando dopo l'idrolisi acida fatta con acido cloridrico, questa separa basi azotate e lo zucchero il cui gruppo aldeidico reagisce col reattivo di Schiff. Sostanze fluorescenti colorano DNA legandosi a Tiamina-Adenina (DAPI), o a Citosina-Guanina (CAM3).

Citochimica di affinità

Tecniche che sfruttano il legame tra ligando e sito di legame per dimostrare quest'ultimo:

• Ligando: molecola estranea ad un compartimento della materia vivente capace di legarsi a una molecola di tale compartimento.
• Sito di legame: molecola di un compartimento della materia vivente capace di legarsi a un ligando.
• Recettore: sito di legame che legando col ligando causa la cascata segnalatoria che modifica il compartimento in cui esso si trova.

L'unione ligando e sito è garantita da legami deboli, efficaci in quanto numerosi e congruenti tra loro. Proteine vegetali della famiglia delle lecitine legano a pacifici residui zuccherini, ciò ha incrementato lo studio di polisaccaridi, membrana cellulare, compartimenti interni e meccanismi (adesione, riconoscimento cellulare). Sono usate lecitine coniugate con opportuni marcatori che permettono la localizzazione di glicoproteine in superficie.

Immunoistochimica

È la branca dell'istochimica che analizza le reazioni tra antigene e anticorpo.

• Antigene: è una sostanza estranea all'organismo caratterizzata da uno o più epitopi, ovvero siti specifici che nel caso di antigeni proteici sono rappresentati da segmenti di decine di amminoacidi.
  • Policlonale: da coniglio, si dirige verso vari epitopi
  • Monoclonale: da topo, si dirige verso il singolo epitopo
• Anticorpo: ha forma a Y, composto da 4 catene proteiche, due leggere e due pesanti unite da ponti disolfuro. Hanno una parte che si lega all'aptene variabile formata da catena pesante e leggera, e l'altra costante formata da catene pesanti.

Il legame antigene-anticorpo si ha con legami deboli e numerosi. Con anticorpi marcati con sostanze fluorescenti si può evidenziare particolari antigeni nelle cellule.

Metodi

• Diretto: usa anticorpi primari marcati con colorante fluorescente. Il sito di legame ha intensità molto bassa visibile al microscopio a fluorescenza.
• Indiretto: lega agli anticorpi primari uno o più anticorpi secondari marcati con colorante fluorescente, così il segnale fluorescente è forte e visibile.

Ibridazione in situ

Localizza sequenze di DNA o RNA su cellule o tessuti. L'ibridazione in situ si basa sulle sequenze nucleotidiche complementari che si appaiano tra loro in particolari condizioni sperimentali, la marcatura di una delle due sequenze localizza la sequenza bersaglio a cui si appaia.

Analisi di immagine

Partendo da un'immagine simile a quella ricreata, è possibile effettuare analisi dettagliate dei campioni osservati.