Riassunto esame Chimica analitica farmaecutica, Prof. Orlandini Serena, libro consigliato Riassunto Elettroforesi, Convalida e Disegno Sperimentale, Lorenzo Coppini

Elettroforesi Capillare

è una tecnica separativa, si basa sull'applicazione di un campo elettrico agli estremi di un capillare di 10 - 100 micron di diametro e 10 cm con lunghezza elevata di almeno 30 cm. Questo si chiama background elettico.

La migrazione è soggetta ad un forte campo elettrico alle estremità della stessa specie da separare all'interno del capillare si determinano delle forze dovute a cariche elettriche diverse. Verso il catodo e l'anodo. A seconda di alcuni parametri le specie si muovono qui:

• Caratteristiche chimico-fisiche (massa, carica, forma)
• Campo elettrico applicato
• Caratteristica del BGE (pH, conc. e additivi)

Le estremità del capillare riempito di BGE quando viene messa nella macchina si trovano all'estremo di 2 grosse sacchetazioni BGE in corrispondenza degli elettrodi. Il centro del capillare si troverà in corrispondenza del caldato (e poi mettere l'uscita del capillare in corrispondenza del monitor).

Il campione è caricato nel capillare sostituendo i due compartimenti (di solito all'anodo) o comunque immettendo il campione ed effettuando l'iiniezione all'interno del capillare.

1. Si effettua il risci capillare
2. Si riempie di BGE
3. Si infetta il campione
4. Si ripresa BGE e annotare il campione e applica campac

Tempo Migrazione (mm/h)

Segnale Amilico (Dipende dal Rivelatore)

Una sequenza di picchi gaussiana separati tra loro è scritta su un tracciato che fornisce dei dati da cui si possono fare delle buone analisi.

Il tempo di analisi non è molto e l'elettroferogramma è correlato con la concentrazione del soluto. Mentre la concentrazione cresce nel tempo.

La risposta del rivelatore cresce in modo grave e appare correlata al tempo e al picco della rivelatore.

L'elettroferesi capillare a livello farmaceutico ha molte applicazioni ed è fra le tecniche più usate.

Effetto dissolutore e limitare la separazione dei soluti.

Basso volume di campione 1-50 µl.

Tempo ridotto e analisi di qualità.

• Alto Potere Risolvente e tempi di picchi stretti e separati.
• Molta moda di separazione e selettività.
• Diversità analisi.
• Ricche di piccolo volume di campione 1-50 ml.
• Autonomazione mezzo con operatore presente.
• Basso flusso elettrosmotico.
• Robustezza capillare.

Quando si trasporta con flusso elettrico verso anodo, effetti di campo e trasporto, anche se microscopico.

Questo causa maggiore trasporto nel flusso elettrico osmotico (che va da polo positivo a polo negativo).

Mobilità Elettroforetica Apparente

È il risultato della somma della mobilità elettroforetica effettiva e la mobilità del flusso elettrosmotico.

Le quote di mobilità che osserviamo facendo l'analisi, grazie a ciò che si possono avere componenti o specie positive che altrimenti resterebbero più vicino del capillare.

Ordine di Separazione

Questo ordine di separazione è dato dal fatto che la mobilità elettroforetica effettiva delle specie positive è piccola e maggiore perché possediamo un raggio più piccolo.

La mobilità elettroforetica teorica diceva che più sono piccole più la mobilità è elevata;

... rimarranno al centro del capillare saranno le particelle, creando un profilo elettrosmotico che sarà più omogeneo.

All'interno del capillare ho galoppi a diversa temperatura e si creano dei moti convettivi.

Il consiglio è di lavorare con correnti basse...

... crescono al centro del capillare composto...

La curva di calibrazione per elettroforesi prevede:

• Ordinata: rapporto delle aree corrette di analiti trattate area corretta standard interno
• Ascisse: rapporto delle concentrazioni, concentrazione analiti trattata concentrazione standard interno

Se uso stessa concentrazione pure per standard ed analiti uso standard interno, ma se lo posso mettere analita, unicamente la conc dell'analita

C Z E

Fino a questo punto abbiamo parlato di un tipo unito di elettroforesi capillare chiamato CZE cioè elettroforesi capillare zonale, con la quale possiamo separare specie in base al rapporto carica/massa ed ha dei limiti come ad esempio impossibilità la separare specie neutre

• BgE: è un semplice tampone Acquoso e separazione basata esclusivamente sulla mobilità degli analiti, dovuta al rapporto carica/massa specie neutre, non possono essere separate

Per separare soluti neutri devo usare delle fasi, che possono essere stazionarie o pseudostazionarie

Separare Soluti Neutri

• Fase Pseudostazionaria → MEKC MEKC
• Fase Stazionaria → CEC

Modalità Operative

MEKC: Elettroforesi Capillare Micellare, Separazione basata sulla ripartizione tra fase micellare e tampone acquoso

MEKC: Elettroforesi capillare a base di Microemulsioni, Separazione basata sulla ripartizione tra fase dispersa delle microemulsione e fase disperdente acquosa

CEC: Elettro cromatografia tecnica ibrida tra elettroforesi capillare e cromatografia liquida

Fase stazionaria che troviamo in CEC significa che ci sono due fasi, solidi come in Cromotografia Ferme nell'interno del capillare. La Fase pseudostazionaria come in MEKC MEKC consiste in fasi all'interno del contenitore con una propria mobilità (similmente nel BGE monomero ferme).

Scegliendo una modalità operative tra MEKC MEKC e CEC è possibile separare soluti neutri in base alla loro ripartizione tra le fasi.

• I soluti grandi sono separati anche secondo di 2 meccanismi cioè sono separati sia per la loro diversa ripartita come tale sazie e sia in base alla loro diversa mobilità elettroforetica

A seconda dello scopo della procedura analitica devono essere considerati gli appropriati parametri di convalida:

• Parametro
• Caso di Identific.
• Determin. Impurezza
• Test Limite Impurezza
• Dosaggio

• Specificità + + + +
• Robustezza + + + +
• Linealità - - - +
• Range di Linearità - - - +
• Accuratezza - ( ) ( ) +
• Precisione - ( ) ( ) +
• LOD - + + -
• LOQ - - - +

A seconda se noi ci troviamo in 1 dei 4 casi possibili da procedura analitica, ci sono parametri diversi per la convalida che devono essere considerati.

I.C.H. descrive i parametri di convalida: è un organo internazionale riconosciuto

• + Il “+” indica che per quella certa procedura analitica il corrispondente parametro è richiesto
• - Il “-” indica un parametro non richiesto per la convalida di quella certa procedura analitica

Per ricordarsi i parametri, bisogna tenere a mente che vanno a coppie!

Parametro 1: Specificità o Selettività

è un parametro di convalida da valutare assai accurato di il nostro metodo analitico risponda ai requisiti per essere specifico.

Specificità e Selettività, un metodo è specifico quando ha la capacità di misurare analiticamente il campione in assenza di interferenze.

Questo rientra in un metodo di tipo spettroscopici nel solo analita! Ci sono metodi di tipo spetto e non per individuare il nostro metodo con interferenze.

La selettività invece è la capacità di fornire risposte positive in presenza di più composti. (es mg analiti nello stesso campione)

Un genere con metodo selettivo se più comune di uno specifico come cromatografici oppure elettroforesi capillare. l'esempio quando leggo una risposta A grande.

Questo è un metodo selettivo, fosse stato specifico avrei visto l solo picco.

Il parametro base di qualsiasi procedura analitica è proprio la specificità. La selettività non è sempre richiesto e il grado di selettività richiesta varia a seconda della procedura analitica.

• Se non da fare con una tecnica volumetrica come una titolazione la selettività è bassissima. (max 2-3 acidi o basi aminoacidiche contemporaneamente).
• Al contrario con un'elettroforesi posso analizzare 20 - 30 analiti, per volta.