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La replicazione del DNA negli eucarioti
La replicazione del DNA negli eucarioti avviene solo e soltanto durante la fase S del ciclo cellulare, tuttavia durante le altre fasi, in particolare la G1, avviene la sintesi dei complessi d'inizio della replicazione. L'unità replicativa degli organismi si chiama replicone, la regione di DNA che viene replicata da una singola origine di replicazione. Nei genomi procariotici, in particolare E. Coli, in cui il genomaè
circolare,
vi
è
un’unica
origine
di
replicazione
e
quindi
un
unico
replicone.
Negli
organismo
eucariotici
ci
sono
fino
a
30000
origini
di
replicazione
e
quindi
altrettanti
repliconi.
Vi
sono
elementi
sul
DNA
che
fanno
in
modo
di
originare
la
replicazione
in
quel
punto
e
non
in
altri:
in
particolare,
ad
esempio
in
E.
Coli,
l’origine
della
replicazione
è
costituita
da
una
serie
di
blocchi
di
sequenze
specifiche.
Questi
blocchi
garantiscono
attraverso
il
coinvolgimento
di
apposite
proteine,
che
riconoscono
tali
sequenze,
che
il
macchinario
di
replicazione
venga
posizionato
in
quel
punto
e
non
in
altri.
Questo
impedisce
che
vi
sia
la
possibilità
di
iniziare
in
maniera
non
coordinata
la
replicazione
del
DNA.
Le
proteine
che
riconoscono
tali
sequenze
in
modo
specifico
fungono
da
iniziatori
della
replicazione.
Oltre
a
queste
sequenze
di
DNA,
che
Sono le uniche responsabili del posizionamento di tali proteine, il processo d'inizio avviene grazie a delle sequenze, giustapposte in posizione prossimale ai siti di legame per l'iniziatore, che sono ricche in sequenze A-T. Questa caratteristica consente a questi tratti di DNA di essere facilmente denaturati, perché meno stabili degli accoppiamenti G-C. Successivamente c'è l'origine di replicazione vera e propria,
dove
viene
sintetizzato
il
primer
d'innesco.
L'iniziatore
lega
la
sequenza
iniziatrice;
successivamente
comincia
a
denaturare
il
DNA;
in
seguito
entrano
le
elicasi,
che
ampliano
la
superficie
della
bolla
e
reclutano
la
primasi
per
l'introduzione
del
primo
innesco
a
RNA.
Il
processo
poi
si
svolge
con
le
seguenti
modalità.
1. La
primasi
estende
un
primer
di
RNA
su
entrambi
i
filamenti.
2. Il
filamento
leading
entra
direttamente
nella
polimerasi
e
viene
esteso,
quello
lagging
εviene
bloccato
dalla
pinza
scorrevole.
3. La
pinza
porta
il
filamento
lagging
con
il
primer
alla
polimerasi
che
comincia
a
δ,
estenderlo.
Negli
eucarioti
la
replicazione
è
un
processo
più
complicato,
a
causa
della
presenza
di
numerose
origini
della
replicazione
necessarie
per
garantire
la
duplicazione
dell’intero
genoma,
molto
più
esteso
di
quello
di
una
cellula
procariota.
Infatti,
il
più
piccolo
cromosoma
umano
è
dieci
volte
più
grande
di
quello
di
un
batterio.
È
indispensabile
che
vi
sia
un
coordinato
meccanismo
che
consenta
di
replicare
il
genoma
un’unica
volta
durante
il
ciclo
cellulare.
Le
origini
partono
in
tempi
diversi
con
una
precisa
gerarchia:
se
si
parte
da
una
bolla,
le
altre
origini
vicine
vengono
inibite.
La bolla replicativa è quindi gerarchicamente dominante sulle altre origini. È possibile guardare le bolle replicative nelle cellule dando loro della deossiuridina modificata con l'inclusione di un atomo di bromo: questo viene incorporato nel filamento neosintetizzato e successivamente riconosciuto da particolari anticorpi.
Uno dei meccanismi attraverso cui è assicurata un'unica replicazione per ciclo cellulare funziona grazie a delle proteine.
La cui espressione è modulata durante le quattro fasi del ciclo. Durante la fase G1 vi è un importante processo, assente nei procarioti, il posizionamento di complessi pre-origine di replicazione, sui siti di origine di replicazione. Questi complessi sono inattivi, durante la fase G1 rimangono in loco; a questi complessi poi si legano gli iniziatori, seguito dal legame dei caricatori delle elicasi (cdt6 e cdt1). I
caricatori sono i bersagli di regolazione da parte di proteine regolate durante il ciclo cellulare, le chinasi ciclino-‐dipendenti. L'iniziatore (ORC nei mammiferi), il replicatore, i caricatori delle elicasi e le elicasi compongono il complesso di pre-‐replicazione che viene posizionato negli eucarioti già durante la fase G1. È simile a quello dei procarioti ma è inattivo: i segnali che lo attivano provengono dal
ciclo cellulare e sono segnali di fosforilazione, da parte di chinasi che sono espresse in relazione alla fase del ciclo cellulare. Di queste chinasi, di cui si ricordano quelle ciclino-‐dipendenti (CDK), durante la fase S viene aumentata l’attività: queste proteine sono in grado di fosforilare i substrati del complesso pre-‐replicazione, in particolare i caricatori delle elicasi. La fosforilazione dei caricatori è l’evento
Che fa iniziare la replicazione di quel replicone, perché attiva il complesso replicativo. L'evento principale è il reclutamento sul complesso degli enzimi con attività polimerasica, la primasi e la polimerasi. I caricatori quindi si staccano. Dopo il reclutamento delle p
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