Produzione delle proteine

RNA

La sintesi avviene in direzione 5’ 3’

Gli RNA vengono sintetizzati copiando un singolo filamento di DNA (detto filamento di

senso) secondo la legge della complementarità (con unica eccezione che A è

complementare ad U)

Il filamento non codificante viene chiamato filamento non senso

Quindi il filamento di RNA sarà complementare al filamento di senso e uguale al filamento

non senso

5’CCGGAAGGCT3’filamento di non senso

3’GGCCTTCCGA5’ filamento senso (codificante)

5’CCGGAAGGCU3’ RNA

Vengono utilizzati nucleotidi trifosfati per fornire energia (ATP, UTP, CTP, GTP)

L’enzima che sintetizza RNA è la RNA-POLIMERASI capace di iniziare la sintesi dal primo

nucleotide: non necessita quindi dell’innesco (primer)

La timina rispetto all’uracile è più stabile poiché è presenta la molecola CH3

 Differenze della trascrizione tra procarioti ed eucarioti

Procarioti

1 sola RNA-polimerasi per mRNA, tRNA e rRNA 23S, 16S, 5S.*

L'RNA-polimerasi è composta da:

core (subunità 2α, β, β') e subunità sigma (σ)

La polimerasi deve trascrivere una determinata sequenza di DNA corrispondente ad un gene.

A monte della zona che dovrà essere trascritta esiste una zona di regolazione per il preciso e

corretto attacco dell'RNA polimerasi: PROMOTORE

*I ribosomiali si misurano in unità Svenberg; tengono conto della densità e della velocità di

sedimentazione durante la centrifugazione poiché non è possibile determinare l'alto numero

di nucleotidi.

Inizio della trascrizione

La subunità sigma si lega al core ed esplora il DNA sino a trovare una sequenza a – 35 nt dal

sito di inizio della trascrizione (ricca in T ed A), detta PRIBNOW BOX, alla quale si lega.

Una volta legata induce il DNA a srotolarsi aprendo una bolla di trascrizione e posizionando

il core in modo preciso perché copi il primo nucleotide (+1) e successivamente gli altri.

Dopo aver iniziato la trascrizione, sigma si stacca e va a legarsi ad un altro core.

Il legame tra i vari nucleotidi viene formato dalla subunità β mentre β’ serve a tenere legato il

DNA.

Terminazione

Esistono due metodi per concludere la trascrizione:

a) presenza di sequenze di terminazione (palindromiche) sul DNA: sequenze

complementari invertite distanziate da un tratto centrale variabile ES. -

GCCCAACCGGACGGGCU-

Queste sequenze una volta trascritte formano una struttura a stelo (più o meno complesse)

che sgancia l’RNA trascritto dal legame con la polimerasi e con il DNA.

b) In alcuni casi interviene anche una proteina detta proteina Rho (ρ) che favorisce la

terminazione legandosi alla parte terminale dell’RNA sganciandolo.

Eucarioti

Il processo di trascrizione ha le stesse modalità descritte in Procarioti con alcune differenze:

a) Il DNA è complessato con proteine istoniche che devono essere temporaneamente

allontanate per permettere la trascrizione

b) La trascrizione avviene nel nucleo

c) Esistono 3 tipi di RNA-polimerasi:

o RNA-polimerasi I per rRNA 28S; 18S; 5,8S (nel nucleo)

o RNA-polimerasi II per mRNA (nel nucleo)

o RNA-polimerasi III per tRNA e rRNA 5S (nel nucleo)

d) È richiesta la presenza di fattori trascrizionali generali perché la RN-polimerasi possano

iniziare la trascrizione, in quanto non esiste il corrispondente del fattore sigma

e) gli RNA trascritti (PRIMARI) debbono subire delle trasformazioni (MATURAZIONE) prima di

passare nel citoplasma ed essere funzionali

f) trascrizione e traduzione non sono contemporanee

Sia in PROCARIOTI sia in EUCARIOTI molte polimerasi si legano in sequenza al DNA per

cui molti filamenti di RNA vengono trascritti dallo stesso gene in breve tempo.

RNA-POLIMERASI II

Si trova nel nucleo.

- trascrive RNA primari (hnRNA) che successivamente verranno modificati (maturazione) per

dare mRNA funzionanti.

- Per iniziare ha bisogno di fattori trascrizionali generali (D, B, F, E, H).

- Tali fattori si legano ad una sequenza del promotore detta TATA BOX (-40).

Esistono anche a monte della TATA BOX sequenza ricche di CG e CAAT BOX

Maturazione del trascritto primario (hnRNA)

1) Al 5’ aggiunto un nucleotide (7-metilguanosina) detta Cap con funzione di protezione dalla

degradazione e funzione specifica nella traduzione.

2) Una polimerasi specifica aggiunge al 3’ una lunga catena: (100-200) nucleotidi di A (poli A)

con funzione di protezione dalla degradazione

3) L’hnRNA è costituito da sequenze dette: o Esoni (codificanti)

o Introni (non codificanti)

Grazie ad un meccanismo complesso che prevede l’intervento di ribonucleoproteine, piccoli

e grandi RNA (spliceosoma (splicing)) gli introni vengono escissi e gli esoni vengono saldati tra

loro.

NUMERO DEGLI ESONI = NUMERO DEGLI INTRONI + 1

La traduzione

Durante la traduzione le principali molecole che giocano un ruolo fondamentale sono:

- mRNA: codice per la sintesi di una determinata proteina

- tRNA: ogni molecola è specifica per il trasporto di un determinato aminoacido. Inoltre,

converte sequenze di nt in sequenze amminoacidi

- ribosoma: permette il corretto appaiamento tra mRNA e i diversi tRNA. Inoltre, partecipa

attivamente alla formazione della catena proteica

 struttura molecolare del tRNA

Nel piano: il filamento assume una forma a quadrifoglio

- 2 zone a bracci in cui le basi sono appaiate

- 2 anse senza appaiamento (basi modificate post-trascrizionalmente)

ANSA D: vi si lega l'enzima aminoacilsintetasi specifico per legare un determinato

aminoacido al suo tRNA

ANSA dell'ANTICODONE: contiene una tripletta complementare e antiparallela al codone

che sull'mRNA codifica per un determinato aminoacido Un'ansa variabile

ANSA del TϕC (ϕ=pseudouracile): legame con rRNA 5S della subunità grande del ribosoma

L'aminoacido con il suo gruppo carbossilico (-COOH) si lega all'-OH del C3 del ribosio del

nucleotide (A) al 3' del tRNA. Le aminoacil-sintetasi sono 20, una per ogni aminoacido.

Ognuna trasferisce un AA diverso sul rispettivo tRNA.

 Struttura molecolare del ribosoma

Il ribosoma ha una struttura molecolare complessa formata da rRNA e proteine ribosomiali.

Negli eucarioti gli rRNA vengono prodotti nel nucleolo (tranne il 5S: nel nucleo) dove

entrano anche le proteine ribosomiali (prodotte nel citoplasma) che si assemblano con i

rispettivi rRNA per formare i ribosomi.

Nei procarioti tutto ciò avviene nel citoplasma.

I ribosomi procariotici sono più piccoli dei ribosomi eucariotici.

Le differenze tra ribosomi procariotici ed eucariotici sono dovute al numero e alle grandezze

diverse degli rRNA e delle proteine. I ribosomi sono formati da due subunità (piccola e

grande) che si assemblano solo al momento della traduzione (le due subunità ribosomiali

si assemblano e diventano funzionali solo in presenza di mRNA).

Perché avvenga la traduzione è necessario passare da un linguaggio fatto di nucleotidi ad

un linguaggio di amminoacidi.

Gli aminoacidi presenti in tutte le proteini sono 20 mentre le basi sono solo 4.

Se ogni base specificasse per 1 amminoacido avremmo slo 4 aminoacidi specificati 4^1 = 4

Se la combinazione di due basi specificasse per 1 aminoacido avremmo 4^2 = 16 aminoacidi

specificati

Se la combinazione di tre basi specificasse per 1 aminoacido, avremmo 4^3 = 64

combinazioni per 20 amminoacidi

Il codice pertanto è a triplette, cioè la combinazione di tre basi specifica per 1 aminoacido

Ogni tripletta è detta CODONE

Esistono 3 triplette che non codificano per nessun aminoacido e sono dette di STOP (UAG;

UAA; UGA)

Ci sono 64-3 (codoni di stop) = 61 triplette per 20 aminoacidi

- il codice genetico è DEGENERATO o RIDONDANTE: ogni aminoacido può essere specificato

da più di un codone

- i codoni che specificano lo stesso aminoacido sono diversi soprattutto nella terza base

 CARATTERISTICHE DEL CODICE GENETICO

UNIVERSALE: uguale per tutti gli esseri viventi tranne alcune eccezioni

NON AMBIGUO: un determinato codone specifica per un solo aminoacido

senza punteggiature: viene letto linearmente (di tre basi in tre basi) e non è sovrapponibile (es.

la stessa base non può essere letta come l’ultima di un codone e la prima del successivo)

TRADUZIONE

1) la lettura dell’mRNA procede in direzione 5’ 3’

2) la sintesi proteica procede: • dall’estremità N-terminale

• all’estremità C-terminale del polipeptide

3) la traduzione ha inizio sempre con: • Formil-metionina in procarioti

• Metionina

Il codone per Metionina è AUG

L’anticodone è UAC.

1 L’inizio

L’mRNA si lega alla SUBUNITA’ PICCOLA ribosomiale e al tRNAmet (codone con anticodone)

grazie a fattori di inizio e ad 1 GTP  GMP+P+P che dona energia necessaria per il legame.

L’mRNA in procarioti si lega con la sequenza SHINE-DALGRARNO al rRNA 16S, mentre in

eucarioti l'mRNA si lega con il 5’ -cap (7- metilguanosina) al rRNA 18S.

Successivamente si assembla la SUBUNITÀ GRANDE contenente due siti detti A e P per

accogliere i tRNA. Solo il 1° tRNAmet si lega direttamente al sito P.

2 L’allungamento

Il 2° tRNA con l’AA corrispondente si lega all’mRNA (2° codone/anticodone) e alla subunità

grande, nel sito A, grazie a fattori di allungamento e ad 1 molecola di GTP.

Il legame che si forma tra i due AA avviene tra il gruppo carbossilico (COOH) della metionina e

il gruppo amminico (NH2) del 2° AA (legame peptidico)

L’enzima responsabile è la Peptidil-transferasi.

Dopo la formazione del legame peptidico, il 1° tRNA, rimasto scarico della metionina, viene

allontanato dal sito P.

Avviene quindi la traslocazione:

l’mRNA scivola di un codone trascinandosi il 2° tRNA che passa dal sito A al sito P, lasciando il

sito A libero per l’attacco del 3° tRNA.

Questa traslocazione è mediata da un fattore di traslocazione e dalla scissione di una

molecola di GTP

Il ciclo si ripete tante volte quanti sono gli AA che devevono essere legati.

3 terminazione

quando sul sito A si trova un codone di STOP, a cui non corrisponde nessun tRNA, la sintesi si

arresta.

Inoltre esistono fattori di rilascio che si legano al sito A impedendone comunque l’attacco dei

tRNA

La catena polipeptidica si stacca dall’ultimo tRNA grazie ad un enzima (idrolasi) con un

consumo di energia.

Le due subunità ribosomiali si disassemblano

Il vacillamento delle basi

Il legame tra codone e anticodone è complementare e antiparallelo

Esempio:

3’CAG5’ (anticodone)

5’GUC3’ (codone)

Il numero dei codoni