5 a Proteine eterologhe: produzione di p. Eterologhe nei lieviti saccharomycaes; produzione di p. Eterologhe in cellule di insetto; produzione di p. Eterologhe in cellule di mammifero+ il bacmide + purificazione p. Eterologhe

Espressione nelle cellule di lievito

Quando si effettua l'introduzione di DNA esogeno negli eucarioti, si parla di transfezione. Tuttavia, quando si lavora con colture cellulari di lievito, si continua a utilizzare il termine trasformazione, lo stesso utilizzato nei procarioti, nonostante i lieviti siano organismi eucarioti.

Ricordiamo che i lieviti hanno una parete cellulare piuttosto spessa, il che impedisce l'entrata del costrutto contenente il gene della proteina. Quindi, per prima cosa, si effettua la rimozione di questa parete cellulare utilizzando metodi chimici o enzimatici, come l'utilizzo degli enzimi cellulasi e pectinasi. La cellulasi degrada la cellulosa, mentre la pectinasi degrada la pectina. La cellulosa e la pectina sono due importanti componenti della parete cellulare. Più specificamente, la pectina è un carboidrato costituito da monomeri di acido galatturonico uniti da legami alpha-1,4 gliosidici. È importante non confondere il termine pectina con il termine amilopectina, che è...

Una forma di amidocostituita da monomeri di glucosio a formare delle strutture ramificate). La cellulosa è costituita da unità di glucosio unite tra loro da legami beta-1,4 glicosidici. La cellulosa risulta essere molto simile all'amilosio, che è un'altra forma dell'amido in cui le unità di glucosio sono unite per mezzo di legami alpha-1,4 glicosidici. La cellulosa differisce dall'amilosio per il semplice motivo che le unità di glucosio risultano ruotate di 180° l'una rispetto all'altra: CELLULOSA AMILOSIO PECTINA AMILOPECTINA Dopo aver rimosso la parete cellulare si ottengono i cosiddetti protoplasti, cioè una cellula costituita da membrana che avvolge il contenuto citoplasmatico. Ora si può, quindi, effettuare la trasformazione delle cellule di lievito aprendo dei pori a livello della membrana cellulare attraverso la tecnica dell'elettroporazione. In alternativa, si può utilizzare il METODO

DELL'ACETATO DI LITIO, secondo il quale le cellule di lievito vengono trattate con una Trasformation Mix, i cui componenti principali sono acetato di litio, glicole polietilenico (PEG), Tris-HCl ed EDTA. L'acetato di litio permeabilizza la parete cellulare, mentre il glicole polietilenico facilita l'ingresso del DNA nella cellula.

COME ESTRARRE LA PROTEINA ETEROLOGHE DALLE CELLULE DI LIEVITO

Le proteine eterologhe, una volta prodotte, si accumulano nel citoplasma: ciò significa che per estrarre la proteina d'interesse bisognerà rompere le cellule di lievito. Un esempio è quello della produzione di un enzima, chiamato Cu/Zn Superossido dismutasi. È un enzima che agisce in presenza del rame e dello zinco e ha il compito di degradare l'anione superossido (O2-) che è citotossico: l'anione superossido, in presenza del superossido dismutasi, viene convertito in acqua ossigenata, la quale, in presenza della catalasi, verrà

1. un gene per la resistenza all'ampicillina (Amp);
2. un gene LEU2;
3. due origini di replicazione di lievito (sequenza b);
4. una origine di replicazione di E. coli;
5. cDNA del gene per la dismutasi, che viene messo sotto l'influenza di un promotore forte (è stato scelto quello della fosfogliceraldeide deidrogenasi (GAPDp); della gliceraldeide deidrogensasi si utilizzano anche le sequenze di arresto e di poliadenilazione (GAPDt).

è pensato di trovare il modo per far secernerele proteine eterologhe da parte delle cellule di lievito. Le proteine, in generale, perraggiungere il loro sito specifico, che può essere la membrana citoplasmatica, lamembrana nucleare, l’ambiente extracellulare ecc., sono dotate di una sequenzasegnale, che rappresenta una sorta di indirizzo delle proteine. Nel caso delle proteinericombinanti si è pensato di creare delle proteine ricombinanti di fusione: nelvettore di espressione, cioè, il gene di interesse viene fiancheggiato da una sequenzache codifica per la sequenza segnale di una determinata proteina. Nel caso dellasuperossido dismutasi, ad esempio, vogliamo che questo enzima venga riversatoall’esterno delle cellule di lievito. Generalmente le proteine prodotte dal lievitovengono mantenute nel citoplasma, poche altre vengono secrete nell’ambienteextracellulare. Ed è proprio durante il passaggio dall’ambiente

intracellulare all'ambiente extracellulare che queste proteine subiscono la maggior parte delle modificazioni post-traduzionali. Quindi indurre la secrezione della proteina eterologa è vantaggiosa sia per quanto riguarda la sua purificazione che risulta, di conseguenza, più facile; ma è vantaggiosa anche perché in questo modo la proteina etereloga che deve subire una determinata modificazione post-traduzionale, di sicuro la subirà durante la secrezione. È stato osservato che le cellule di lievito secernono verso l'esterno un particolare ferormone. In pratica, le cellule di lievito possono presentarsi in forma diploide, ma anche in forma aploide. Due cellule di lievito aploidi possono fondersi tra loro generando un individuo diploide. Le cellule aploidi devono essere eteroalleliche: ad esempio, nel caso dei mammiferi le cellule aploidi che si fondono sono spermatozoi e cellule uovo, cioè gamete maschile e femminile. Nel caso dei

lievitinon si può effettuare questa distinzione maschio-femmina, ma le cellule aploidi di lievito sono distinte in base a un particolare gene, chiamato MAT. Infatti, ci sono cellule aploidi di lievito che contengono l'allele MAT-alpha e cellule aploidi di lievito che contengono l'allele MAT-a. Le prime producono un ferormone, chiamato ferormone alpha-factor; le seconde producono il ferormone a-factor. Queste cellule secernono questo ferormone per indicare alla cellula opposta la sua presenza in modo da far avvenire l'accoppiamento. Entrambi i ferormoni, quindi, vengono secreti nell'ambiente extracellulare e per farlo sono dotati di una sequenza segnale che le indirizza verso l'esterno. Il ferormone alpha-factor viene prodotto in forma di precursore, chiamato prepro-alpha-factor, il quale a livello del reticolo endoplasmatico subisce la glicosilazione in tre siti con conseguente attivazione a alpha-factor. La sequenza segnale del prepro-alpha-factor è

quella che viene utilizzata per indirizzare la proteina eterologa verso l'ambiente extracellulare. Quindi, nel caso in cui la proteina eterologa di interesse sia la dismutasi, il vettore di espressione corrispondente conterrà il gene per la dismutasi fiancheggiato dalla sequenza segnale del fattore prepro-alpha. Tra questa sequenza e il gene per la dismutasi è presente una sequenza di riconoscimento per una endoproteasi di lievito. L'endoproteasi agirà successivamente per staccare la proteina di interesse dalla sequenza segnale, ottenendo, quindi, solo la proteina eterologa.

Un altro esempio di proteina eterologa prodotta con vettori di espressione inseriti in cellule di lievito è l'irudina. Anche per la produzione di questa proteina è stata creata una proteina di fusione come quella descritta precedentemente in modo tale che essa venisse indirizzata verso l'ambiente extracellulare. L'irudina è l'esempio palese

diproteina che subisce le modifiche post-traduzionali durante il passaggio attraverso la membrana di una cellula di lievito. Infatti essa viene secreta direttamente in forma attiva. Questa proteina svolge funziona anticoagulante ed è prodotta dalle ghiandole perifarigee delle sanguisughe ed è utilizzata per terapie antitrombotiche per i cardiopatici. In realtà, la forma ricombinante dell'irudina prende il nome di lepirudina ed è questa che viene prodotta per mezzo di vettori di espressione ed estratta dalle cellule di lievito. La lepirudina, rispetto all'irudina, presenta una isoleucina, invece di una leucina, all'N-terminale. S.Cerevisiae

Un'altra strategia per migliorare la secrezione di proteine ricombinanti è quella di promuovere un ripiegamento corretto della proteina durante la secrezione. Proprio per favorire l'esportazione, interviene un enzima chiamato disolfuroisomerasi, che ha lo scopo di modificare il ripiegamento

della proteina. InS.Cerevisiae un ceppo è stato modificato per produrre una quantità di disolfuroisomerasi 16 volte maggiore rispetto al ceppo di tipo selvatico (aggiungendo ilpromotore della fosfogliceraldeide deidrogenasi: questo è stato fatto in un sitocromosomico). Nel ceppo così trasformato è stato inserito il vettore con il gene per ilfattore B della crescita, derivante dalle piastrine umane, ottenendo dei buoni risultati:il prodotto del fattore B è risultato 10 volte maggiore rispetto al ceppo selvatico.

ALTRI TIPI DI LIEVITO PER LA PRODUZIONE DI PROTEINEETEROLOGHE S.CerevisiaeL’espressione delle proteine ricombinanti in generalmente è limitata e visono alcuni inconvenienti:

• aumentando la produzione accade spesso che i plasmidi si perdono (primaavevamo detto che sopra i 10 l di soluzione questi plasmidi non reggono!);
• la proteina eterologa può anche essere iperglicosilata: nel momento in cuiviene esportata la

La glicosilazione può essere eccessiva e questo altera le caratteristiche della proteina;

la proteina in altre situazioni potrebbe non essere secreta, ma si va ad immagazzinare nello spazio periplasmatico (spazio compreso tra la membrana plasmatica e la parete cellulare) e di conseguenza bisogna lisare le cellule ed estrarre la proteina eterologa.

A causa di questi inconveniente si è deciso di prendere in considerazione altri lieviti, come:

• Kluyveromyces lactis, utilizzato per la produzione industriale della β-galattosidasi;
• Yarrowia lipolytica;
• Pichia pastoris Hensenula polimorphae (possono utilizzare il metanolo come fonte di carbonio e energia ed infatti si dicono metilotrofici o metanotrofi).

PICHIA PASTORIS è una specie di lievito metilotrofico largamente impiegato per la produzione di proteine tramite l'uso delle tecniche del DNA ricombinante. Pichia pastoris è dotata di due geni per l'enzima alcol ossidasi, il gene AOX1 e il gene AOX2,