5 a Proteine eterologhe: produzione di p. Eterologhe nei lieviti saccharomycaes; produzione di p. Eterologhe in cellule di insetto; produzione di p. Eterologhe in cellule di mammifero+ il bacmide + purificazione p. Eterologhe

Proteine eterologhe

Una proteina è definita eterologa quando non viene prodotta nel suo organismo naturale, ma in un altro organismo. Per poter inserire un gene, ad esempio eucariotico, all’interno di una cellula ospite, come un batterio, bisogna ricombinare un vettore con un gene che codifica per la proteina di interesse. I vettori utilizzati per questo scopo prendono il nome di vettori di espressione. Affinché il gene di interesse venga espresso, esso deve essere integrato nel vettore di espressione insieme al suo promotore e alle sequenze regolatrici della trascrizione.

La produzione di grosse quantità di proteine eterologhe può, tuttavia, avere effetti tossici o rallentare il metabolismo delle cellule ospiti. Per ovviare a questi problemi è vantaggioso utilizzare un promotore inducibile, cioè promotori che vengono attivati solo in presenza di determinati stimoli e di conseguenza anche la trascrizione e traduzione del gene regolato da questo promotore dipenderanno da questi stimoli.

La produzione di proteine eterologhe per mezzo di vettori di espressione ricombinanti è l’unico modo per creare una grande quantità di proteine di interesse farmaceutico, come l’insulina. In questo modo, quindi, è possibile soddisfare il fabbisogno mondiale di proteine, cosa che non sarebbe possibile isolando la proteina di interesse dalla sua fonte naturale. Quest’ultimo procedimento, oltre a non essere adatto per soddisfare il fabbisogno mondiale di una determinata proteina, risulta essere caratterizzato anche da elevati costi.

La produzione di proteine eterologhe è importante perché si possono produrre ormoni, anticorpi, fattori della coagulazione e antigeni per la creazione di vaccini. Le proteine eterologhe vengono prodotte anche con lo scopo di studiarne la struttura. A volte la molecola da studiare non è tanto la proteina prodotta da un determinato gene quanto l’RNA da esso trascritto.

Scelta dell'organismo ospite

È necessario scegliere in quale organismo si vuole produrre la proteina: gli ospiti principali sono E. coli (un batterio molto conosciuto), Saccharomyces cerevisiae (un lievito simile a quelli usati per fare il pane), cellule di Drosophila (moscerino della frutta), Chinese hamster ovary (cellule di criceto cinese) e cellule vegetali di tabacco.

Le cellule batteriche hanno caratteristiche che le rendono dei buoni sistemi cellulari per la produzione di proteine ricombinanti: crescono rapidamente e possono facilmente essere amplificate in terreno liquido, con bassi costi di produzione. I batteri offrono molti vantaggi per esprimere proteine eterologhe, ma hanno anche delle limitazioni. Ad esempio, molte proteine animali, soprattutto quelle dei mammiferi, hanno dimensioni di gran lunga maggiori rispetto alle proteine batteriche e non possono essere facilmente sintetizzate da E. coli: questa difficoltà di sintesi di proteine eucariotiche da parte di E. coli si traduce con la produzione di proteine che hanno una configurazione spaziale errata e, pertanto, queste vengono inglobate in vescicole, chiamate corpi di inclusione.

Corpi di inclusione

I corpi di inclusione sono delle vescicole insolubili che si formano nelle cellule batteriche con lo scopo di inglobare sostanze nutritive che si presentano in abbondanza. È importante che le sostanze in eccesso siano contenute in queste vescicole perché se fossero disperse nel citoplasma ci sarebbe un innalzamento della pressione osmotica con conseguenti eventi sfavorevoli come il richiamo di acqua dall’esterno e possibile lisi della cellula stessa. Nel caso della produzione di proteine eterologhe, i corpi di inclusione conterranno le proteine che hanno assunto una errata configurazione spaziale.

Le proteine eucariotiche nel loro organismo di origine spesso subiscono delle modificazioni post-traduzionali, che risultano essenziali per la funzionalità della proteina stessa; i batteri però mancano degli enzimi in grado di introdurre queste modificazioni e quindi proteine di questo tipo, una volta tradotte all’interno di cellule batteriche, si dimostrano poco stabili, o con ridotte attività biologiche.

Lieviti come sistema di produzione

Molte volte, proprio perché i batteri non possiedono i sistemi enzimatici in grado di produrre modificazioni importanti per le proteine, vengono utilizzate cellule di mammifero come quelle dei criceti cinesi che sono più simili alle cellule umane. L’inconveniente delle cellule di mammifero, rispetto a un batterio, è la minore produzione di proteina e la maggiore complessità nelle tecniche di coltivazione e di purificazione. Chiaramente questo causa un incremento dei costi delle proteine ricombinanti e di purificazione.

Tra le modifiche post-traduzionali che le proteine eucariotiche subiscono, le più comuni sono la glicosilazione, la proteolisi e la fosforilazione. In alcuni casi queste modifiche post traduzionali sono attuate da diversi enzimi; in altri casi sono le proteine stesse ad avere la capacità di apportare autonomamente tali modifiche.

Glicosilazione

La glicosilazione è un complesso sistema di modificazione che può avvenire sia co- che post-traduzionalmente. Esistono sostanzialmente due tipi diversi di glicosilazione: la N-glicosilazione e la O-glicosilazione. La N-glicosilazione si realizza tramite l’aggiunta di una catena glucidica all’atomo di azoto di una catena laterale di asparagina e, negli eucarioti, ha inizio nel reticolo endoplasmatico quando la proteina è ancora in fase di sintesi. Il primo evento consiste nel legame di una catena di 14 zuccheri (2 molecole di N-acetilglucosammina, 3 di glucosio e 9 di mannosio) a un residuo laterale di asparagina. L’oligosaccaride è trasferito come unico elemento dall’azione dell’enzima glicosil-transferasi. Dopo l’attacco, la catena glucidica può essere ulteriormente modificata eliminando alcuni residui di zuccheri. Le proteine che hanno subìto l’attacco della catena glucidica e la sua successiva modificazione sono poi trasportate all’apparato di Golgi. Qui subiscono una serie di ulteriori modificazioni che sono specifiche per ciascuna proteina.

La O-glicosilazione si svolge nell’apparato di Golgi, dove vari zuccheri possono legarsi alla proteina a livello dell’ossigeno delle catene laterali di residui di serina e treonina. Viene aggiunto uno zucchero alla volta e, solitamente, il numero di molecole di zucchero aggiunte nel processo è limitato a pochi residui. Gli zuccheri che vengono aggiunti a una proteina possono avere diverse funzioni: una funzione di targeting, cioè indirizzano la proteina su specifici siti cellulari; una funzione di riconoscimento, cioè nel momento in cui le glicoproteine fungono da recettori, lo zucchero supporta il legame con il ligando; una funzione di stabilizzazione, cioè gli zuccheri stabilizzano la proteina proteggendola dalla proteolisi; una funzione di solubilizzazione, cioè aumentano la solubilità della proteina (glicoproteine private dei loro zuccheri possono diventare insolubili); la glicosilazione determina anche l’aumento della vita biologica di una proteina, ritardando la rimozione dal flusso sanguigno.

Fosforilazione

La fosforilazione di proteine è la modificazione post-traduzionale più frequente nel proteoma degli eucarioti. È stato valutato che circa un terzo delle potenziali proteine del proteoma umano sono fosforilate e che esistono circa 500 enzimi in grado di fosforilare le proteine e 150 capaci di defosforilarle. Gli enzimi fosforilanti sono chiamati proteine chinasi (PK), mentre quelli che defosforilano sono chiamati fosfatasi. La fosforilazione di proteine avviene anche nei procarioti, anche se è estremamente più abbondante negli eucarioti.

Le proteine chinasi catalizzano il trasferimento di un gamma-fosfato dall’ATP su un residuo di serina, treonina o tirosina con liberazione di ADP. A seconda del residuo fosforilato possiamo distinguere le chinasi in 3 categorie: serina/treonina chinasi; tirosina chinasi; chinasi a doppia specificità in grado di fosforilare tutti e tre i residui. La prima categoria è la più abbondante. Anche se meno frequente, la fosforilazione su tirosina non è meno importante. L’introduzione di un gruppo fosfato nella struttura terziaria di una proteina crea l’opportunità di creare nuovi appaiamenti elettrostatici e legami idrogeno che possono determinare una riorganizzazione locale della proteina anche molto drammatica.

Inoltre, l’introduzione di un gruppo fosfato può essere riconosciuta da altre proteine che hanno dei domini specifici per riconoscere proteine fosforilate. Ne deriva che la fosforilazione è una delle modificazioni post-traduzionali più rilevanti per modulare le interazioni proteina-proteina nella cellula: questo spiega perché la fosforilazione gioca un ruolo così rilevante in praticamente tutte le vie di trasduzione dei segnali.

Alcune modificazioni post-traduzionali sono irreversibili e l’esempio più classico consiste nel processamento di proteine tramite rottura del legame peptidico catalizzata da enzimi detti proteasi. La modificazione prende, quindi, il nome di proteolisi. Molte proteine non vengono prodotte in forma attiva, ma viene prodotto un loro precursore che, in seguito all’azione di una proteasi che rimuove una porzione di questo precursore, si attiva. Un esempio di precursore proteico che viene attivato in seguito a proteolisi è il precursore dell’ormone insulina, che prende il nome di preproinsulina.

La preproinsulina contiene all’estremità amminoterminale un tratto idrofobico (chiamato sequenza segnale), alla quale fanno seguito tre regioni indicate con le lettere A, B e C. La sequenza segnale dirige la proteina nel lume del reticolo endoplasmatico, dove è convertita in proinsulina, mediante eliminazione proteolitica della sequenza segnale. La proinsulina è poi trasportata nell’apparato di Golgi e nei granuli secretori, dove la regione C di connessione tra la regione A e B è anch’essa eliminata e i due segmenti A e B sono connessi tra loro, tramite due legami disolfuro, a costituire l’insulina matura che viene secreta.

Produzione di proteine eterologhe in cellule di lievito Saccharomyces cerevisiae

I lieviti sono un gruppo di funghi, formati da un unico tipo di cellula eucariotica, che possono avere forma ellittica o sferica. I primi esperimenti sulle proteine eterologhe vennero fatti utilizzando proprio una cellula di lievito, il lievito Saccharomyces cerevisiae, per vari motivi:

• Perché è un organismo molto semplice e molto conosciuto.
• Perché non è dannoso per l’uomo: è infatti utilizzato anche per la fermentazione della birra, del pane, ecc.
• Perché è facilmente coltivabile.
• Perché non è esigente dal punto di vista nutrizionale.
• Perché conosciamo l’intero genoma e la sua fisiologia.
• Perché presenta al suo interno dei promotori forti, che possono essere utilizzati per far controllare l’espressione del gene esogeno.
• Perché, essendo eucariote, è capace di effettuare numerose modificazioni post-traduzionali, importanti per rendere la proteina eterologa attiva dal punto di vista funzionale.
• Perché secerne poche proteine all’esterno e se la proteina eterologa viene fatta fuoriuscire sarà facile recuperarla nel mezzo di coltura poiché non ce ne saranno altre: questo è senza dubbio un vantaggio, perché nel momento in cui si dovrà effettuare la purificazione della proteina eterologa sarà piuttosto agevole.

Principali vettori di espressione

I principali vettori di espressione che vengono utilizzati per trasfettare cellule di lievito sono:

• Yeast Episomal Plasmid (YEp) o vettori episomiali di lievito. Questi vettori sono molto diffusi, ma presentano una importante controindicazione: risultano instabili per la produzione di quantità di proteina eterologa maggiore ai 10 litri. Come qualsiasi altro vettore, anche i plasmidi episomiali sono caratterizzati da un insieme di siti di restrizione unici e, come nel caso del plasmide pUC19, questi siti sono condensati in un’unica regione che prende il nome di Multiple Cloning Site (MCS). A fianco a questa regione è presente un promotore forte (p) da un lato, mentre dall’altro è presente una sequenza di arresto e di poliadenilazione. In questo vettore è, inoltre, presente una origine di replicazione tipica dei lieviti e un gene marcatore selezionabile come URA3, LEU2, TRP1.
• Yeast Integrating plasmid (YIp) o vettori integranti di lievito. La limitazione di questi vettori è data dal fatto che possono ospitare un solo gene e di conseguenza si avranno rese basse per quanto riguarda le quantità di proteina eterologa prodotta. Si è pensato di creare una sequenza contenente tante copie di uno stesso gene disposte in tandem (una di seguito all’altra) per aumentare la resa, ma il vettore risulta instabile. I plasmidi YIp non hanno un’origine di replicazione e, pertanto, non possono replicarsi autonomamente. Di conseguenza vengono per lo più persi dalla cellula nel corso delle divisioni cellulari, a meno che non vengano integrati da qualche parte in uno dei cromosomi di lievito. Infatti, questi vettori sono progettati proprio in modo tale da poter rendere possibile l’integrazione del gene che codifica per la proteina eterologa all’interno del genoma di lievito e, precisamente, all’interno di una sequenza di un gene non essenziale per il lievito. Come qualsiasi altro vettore, anche questo è progettato con dei siti di restrizione unici e dei geni marcatori selezionabili (URA3, LEU2, TRP1). La peculiarità di questi vettori è quella di presentare delle sequenze omologhe a sequenze del genoma di lievito.