Peptidi e proteine

SINTESI CHIMICA E SEMISINTESI DI PEPTIDI E PROTEINE

Abbiamo visto che le due grandi classi di composti che vengono sviluppati come farmaci: le piccole

molecole e i biologics. Tra i biologics, parliamo essenzialmente delle proteine: abbiamo quindi un range di

pesi molecolari, a partire dai peptidi, che possono essere molto corti fino ad arrivare a grandi proteine. Si

parla di peptidi sui 50 AA. Se volessimo preparare composti più grandi? La sintesi su fase solida permette di

arrivare anche a 70 aa ma non è il metodo migliore, l’ottimo si riscontra intorno ai 30 aa.

Perché avremmo bisogno di nuove proteine fatte da noi? Le proteine hanno tantissime funzioni biologiche

ma non solo, sono catalizzatori molto potenti, farmaci, e sono in grado di legare con affinità e specificità, per

ora insuperabile, alcuni composti; possono formare fibre molto forti ed elastiche ad esempio muscoli,

capelli e tele di ragno.

Perché sintetizzare una proteina anziché produrla in maniera ricombinante? Con la sintesi chimica si può

modificare in maniera più semplice: possiamo introdurre AA non naturali o modificazioni post traduzionali

facilmente e con precisione, cosa che con l’espressione ricombinante non si fa così bene.

Nel 1992 però si registra una crescita esponenziale del numero di AA sintetizzabili, cosa è successo? È stata

introdotta la Chemical Ligation: si prendono due peptidi prodotti con SPPS e si legano tra loro con metodi

chemoselettivi, metodi che sfruttano funzionalità in grado di reagire esclusivamente fra di loro per la

particolarità di essere ortogonali rispetto a tutti i gruppi funzionali delle molecole. Quindi se noi abbiamo un

gruppo all’N terminale di un peptide e un gruppo al C terminale di un altro peptide che reagisce solo con il

precedente gruppo, possiamo unire le due estremità per formare un peptide più lungo.

Che caratteristiche deve avere questo tipo di chimica?

● Deve rendere possibile queste reazioni in acqua;

● nessuna protezione delle catene;

● La reazione deve essere chemoselettiva, di conseguenza deve essere molto veloce ed è infatti

richiesta un’alta concentrazione;

● Va sviluppata per essere utilizzata in condizioni più diluite possibili perché non sempre abbiamo

elevata solubilità dei peptidi stessi.

La chemical ligation permette la formazione di legami sia nativi che non nativi. Si potrebbe pensare che

ottenere il legame peptidico sia la miglior scelta in quanto otteniamo proprio la proteina “naturale”, però ci

sono possibilità di legare frammenti senza che questo perturbi la struttura della proteina. Il vantaggio più

grande è la non necessità di tecniche di deprotezione finale,

passaggi molto complicati e laboriosi; il fatto che i peptidi

siano già deprotetti rende molto più semplice il lavoro,

anche perché quando sono protetti sono poco solubili,

difficili da purificare e maneggiare.

Ci sono ovviamente delle limitazioni anche a queste

tecniche:

● C’è bisogno di metodi efficienti per la sintesi dei

frammenti, partire quindi da peptidi molto puri;

● Reazioni molto veloci, altrimenti si rischiano reazioni

secondarie;

● Complicato operare senza gruppi protettori, quindi

alla fine a volte si usano lo stesso.

In questa Chemical Ligation, entrambi i peptidi durante la sintesi in fase solida devono avere queste due

modificazioni che permettano di legare in maniera estremamente selettiva i due frammenti, e che

permettano la formazione di un legame analogo al legame peptidico così da non alterare la struttura della

proteina.

METODOLOGIE PER CHEMICAL LIGATION

Oxime Ligation

1. : sfrutta la formazione di ossima; permette di formare frammenti in maniera

altamente chemoselettiva usando gruppi specifici da legare all’N-terminale ed al C-terminale.

Questi gruppi sono per esempio: un’idrossilammina da una parte e un gruppo aldeidico dall’altra. Il

gruppo che si forma alla fine è un’ossima. Il catalizzatore usato è l’anilina perché reagisce

velocemente in condizioni debolmente acide (per questo siamo ad un pH leggermente inferiore a 7)

con le aldeidi, formando un’immina (o base di Schiff), che può essere protonata e questo rende

ancora più reattivo il gruppo carbonilico dell’aldeide che reagisce con il derivato dell’idrossilammina

a formare l’ossima. Ovviamente il legame che si forma non è nativo, ma l’ossima è sufficientemente

stabile da garantire la stabilità della molecola.

Hydrazone formation

2. : utilizzando dei derivati dell’idrazina, che possono reagire con l’aldeide

dell’altro frammento. Questa è una reazione simile alla formazione delle basi di Schiff delle immine,

infatti si forma questo gruppo chiamato idrazone. Quindi anche in questo caso, due frammenti

peptidici possono essere coniugati, a seconda di dove mettiamo i due gruppi: testa-testa,

testa-coda, coda-coda.

Click Reaction

3. : Molto usata per le modifiche selettive come marcatura e introduzione di gruppi

non naturali. È catalizzata dal Cu1 tra un azide e un alchino (leggermente acido ma praticamente

inerte in condizioni fisiologiche). Gli alchini normalmente danno le reazioni tipiche dei composti con

un triplo legame, ma nelle condizioni in cui li usiamo per le proteine, sono praticamente inerti;

reagiscono solamente in maniera selettiva con gli enzimi, a dare delle reazioni che si chiamano

“ciclo-riduzioni”, queste reazioni in realtà possono avvenire anche spontaneamente ad alta

temperatura portando alla formazione di triazoli (come quello sostituito in posizione 1,4 nella slide).

Con catalisi del rame si forma solo il triazolo 1,4 sostituito con una reazione che avviene molto

velocemente a pH=7/8 e temperatura ambiente. Questa è una reazione molto comoda per noi

perché ci consente di lavorare in condizioni fisiologiche. Inoltre il triazolo è un composto isostere

con il legame peptidico perché ha distanza simile a quella con il legame peptidico e anche proprietà

chimiche simili. Infine il triazolo è inerte e quindi non da reazioni aggiuntive. Questa reazione è

estremamente chemoselettiva.

Formazione tioetere

4. : ha una struttura molto stabile che permette di legare i due peptidi, per

esempio questo è stato fatto facendo reagire un bromuro con un tiolo per formare il tioetere.

Potrebbe dare delle interferenze con delle cisteine che in tal caso vanno protette.

Formazione ponti disolfuro

5. : chiaramente si instaura tra due cisteine che possono essere presenti

o che possiamo aggiungere. Questo processo è più delicato in quanto suscettibile a riduzione, che

formerebbe due tioli. Questo legame deve formarsi ed il peptide deve essere utilizzato in condizioni

non riducenti.

Formazione tiazolidine

6. : abbiamo la formazione di un legame tra, per esempio, una cisteina ed un

aldeide, con formazione di un composto ciclico che si chiama tiazolidina perché contiene sia lo zolfo

che l’azoto ed è un anello a 5 termini piuttosto stabile.

Formazione tioesteri

7. : gruppi che in natura si trovano

frequentemente, si usano come acidi carbossilici attivati ma che

hanno un reattività intermedia tra un acido carbossilico molto

attivo ed un estere. Per formare il tioestere si utilizza un bromuro

in presenza di un tioacido, ossia un acido in cui il gruppo OH è

sostituito dal gruppo SH. Se questa reazione funziona possiamo

anche pensare di riformare il legame originario sfruttando un

altro tipo di reazione: se noi siamo in grado di formare questo

tioestere inserendo un altro gruppo, come quello amminico,

potremmo sperare in uno scambio tra il tioestere e l’ammide, la

quale è sicuramente più stabile e rende la reazione irreversibile.

L’idea era di usare lo stesso metodo con il bromuro, fare la sostituzione con il tioacetato carico

negativamente per ottenere un composto dal quale fare lo shift; il problema è che non avevano

pensato che il modo più semplice per formare delle tiazolidine è quello di mettere a fianco ad una

ammina un buon gruppo uscente.

Esperimento laboratorio Kent:

Nel laboratorio del professor Kent si fecero la domanda: è possibile trasformare il legame tioestere

in un legame nativo? L’idea era quella di utilizzare questa tecnica: cercare di far reagire il tioestere

con un ammina a formare un ammide. Però non funzionava, la reazione con il bromuro non veniva

bene; allora usarono una cisteina per far sì che il suo tiolo sostituisse il tiolo del tioestere, questo

porterebbe un nuovo tioestere che poi potrebbe riarrangiare. Infatti la reazione procede in maniera

molto veloce, formando un legame nativo.

L’aggiunta di additivi ha aiutato questo tipo di reazione, che comunque procede bene, ma con

aggiunta di un altro tiolo si facilita la reazione perché: la cisteina a pH neutro comincia a dare segni

di ossidazione (soprattutto in presenza di ossigeno) tendendo a formare la cistina, la presenza di un

additivo lo mantiene ridotto; inoltre non solo la cisteina terminale può reagire, ma anche le altre

tenderanno a reagire con il gruppo uscente tiolico del tioestere e quindi la presenza di un additivo

elimina questo problema.

Un primo studio che doveva essere fatto per vedere come procedeva questo tipo di reazione, era

analizzare la reattività degli AA in C-terminale: quindi abbiamo bisogno di una cisteina e capire cosa

vi si può legare. Hanno visto che i più reattivi sono la glicina e la cisteina stessa che reagiscono in

poco tempo, in maniera quasi istantanea. Altri AA sono sufficientemente veloci, e naturalmente gli

AA più grossi e ramificati hanno una reattività minore.

Questo grafico rappresenta l’andamento della reattività dei vari AA.

La prolina è un punto interrogativo, perché come tioestere è la meno reattiva di tutti, ma non è

ancora chiaro il perché, visto che il suo NH dovrebbe essere sufficientemente piatto da reagire bene

su almeno una delle due facce del tioestere, su cui in realtà non reagisce.

Altri studi sono stati fatti usando ad esempio la selenocisteina, al posto della cisteina, per ottenere

delle proteine che contengono la selenocisteina, visto che le proteine che la contengono si stanno

ancora cercando. Sembra che la selenocisteina abbia un ruolo importante nell’attività catalitica di

alcuni enzimi, però sono proteine piuttosto di nicchia. Sfruttando questo metodo hanno potuto

sintetizzare delle vere e proprie proteine come: glutaredoxina, proteina contenente una

diselenocisteina al suo interno.

Limitazione: abbondanza relativa della cisteina nelle proteine. La cisteina non è tra gli AA più

abbondanti tra le proteine, e magari non si trova nemmeno nel