Appunti della lezione di amplificazione del DNA e PCR- Bionanotecnologie 2024

GAP-LIGASE

Una variante della LCR è la Gap Ligase, che utilizza sonde più corte. In questo caso, le sonde si

ibridano solo parzialmente al DNA target, lasciando una parte scoperta che viene completata dalla

DNA polimerasi. Questo processo combina la selettività della LCR con la precisione della PCR,

permettendo di ottenere un'analisi ancora più dettagliata e specifica del DNA target.

Elettroforesi su Gel

L'elettroforesi su gel è un metodo fondamentale per la separazione delle molecole

biologiche, come il DNA, l'RNA e le proteine. Questo metodo sfrutta un mezzo poroso,

solitamente costituito da agarosio (naturale) o da acrilammide (sintetico), che agisce come

una sorta di setaccio molecolare.

Come si misura il DNA?? In bp ovvero base pairs (coppie di basi).

Procedimento:

1. Preparazione del Gel: Il gel viene preparato sciogliendo agarosio o acrilammide in

un tampone, che stabilizza il pH desiderato per la separazione.

2. Caricamento del Campione: Il DNA viene caricato in pozzetti situati vicino

all'elettrodo negativo (catodo).

3. Applicazione della Corrente: Sotto l'influenza di un campo elettrico, le molecole di

DNA, che sono cariche negativamente, migrano verso l'elettrodo positivo (catodo).

4. Separazione delle Molecole: Le molecole più piccole, che incontrano meno

resistenza nel gel, migrano più velocemente rispetto a quelle più grandi. Questo

permette di separare le molecole in base alla loro dimensione.

5. Rilevazione dei risultati: alla fine si ottengono delle bande che si evidenziano con

dei coloranti o con dei marcatori radioattivi

L'elettroforesi su gel consente di determinare il peso molecolare delle molecole di DNA

confrontandole con marker di peso molecolare noto.

SOUTHERN BLOTTING

Il Southern blotting è una tecnica che combina l'elettroforesi su gel con la trasferimento del

DNA su una membrana, seguita dalla rilevazione specifica delle sequenze di DNA.

Procedimento:

1. Separazione del DNA: Il DNA viene separato tramite enzimi di restrizione in pezzi

più piccoli

2. Elettroforesi su gel: separazione in base al peso molecolare

3. Trasferimento su Membrana: Il DNA viene trasferito dal gel a una membrana di

nylon o nitrocellulosa.

4. Ibridazione con Sonda: Delle sonde radioattive o marcate a fluorescenza vengono

inserite nella membrana (di solito sono un frammento di DNA complementare) e

vengono utilizzate per identificare specifiche sequenze di DNA sulla membrana.

5. Rilevazione: La sonda marcata permette di visualizzare le bande di DNA

corrispondenti alla sequenza di interesse.

Northern e Western Blotting

Le tecniche di Northern e Western blotting sono varianti del Southern blotting, utilizzate

rispettivamente per l'RNA e le proteine.

Northern Blotting

1. Separazione dell'RNA: L'RNA viene separato tramite elettroforesi su gel.

2. Trasferimento su Membrana: L'RNA viene trasferito su una membrana.

3. Ibridazione con Sonda: Si utilizza una sonda complementare per rilevare

specifiche sequenze di RNA.

Western Blotting

1. Separazione delle Proteine: Le proteine vengono separate tramite elettroforesi su

gel.