Overview sulle proteine ricombinanti

OVERVIEW SULLE PRODUZIONE DI

PROTEINE RICOMBINANTI

Lunedì 8 marzo 2021

Il vettore di espressione viene amplificato perché ho bisogno di

 amplificare il DNA per disporre di quantità sufficienti di questo

per poter poi realizzare tutti gli step di controllo (verifico di

avere tutte le caratteristiche che voglio) verifico la struttura

generale del costrutto attraverso la definizione di un profilo di

restrizione, posso sequenziare la regione di DNA che contiene

il gene di interesse.

Ripasso possibili enzimi di ligazione:



Scale up (ampiamento della scala di lavoro)

Quando si ottengo dei cloni trasformanti dal ceppo che stiamo

 utilizzando come ospite di espressione, ho la possibilità si

scegliere singole colonie da una piastra su cui è avvenuta la

selezione utilizzando un marker di selezione

Il passaggio su piastra può essere diretto, cioè ottenuta

 direttamente dopo la trasformazione di un certo ceppo oppure

può essere una piastra su cui ho trasferito cellule che vengono

da una glycerine culture (glicerato). Un glicerinato è una

sospensione di cellule che si trovano nel terreno di coltura in

cui sono state amplificate, mescolato con glicerina, in

proporzione diverse a seconda del ceppo utilizzato. Per cellule

di E. coli il rapporto è di solito 1:1.

Dopo aver mescolato bene le cellule nella sospensione è

 possibile stoccarle a -80° così ottengo colture stabili

conservabili anche per anni da cui poi è necessario

“risvegliare” la coltura portandola in condizione di crescita si

estrae da una coltura glicerinata una piccola qualità di

sospensione, fare degli strisci sulla piastra ed ottenere delle

singole colonie.

Le differenze tra un clone e l’altro (tra le colonie) possono

 essere meno marcate tra cloni che siano portatori di plasmidi

di tipo episomale plasmide che si replica all’esterno del DNA

genomico il plasmide è dotato della propria ori quindi si può

replicare indipendentemente dalla sua integrazione nel

cromosoma nelle cellule di E. coli.

Nel caso dei trasformanti ottenuti dalla trasformazione di un

 ceppo di espressione di E. coli con un vettore di espressione,

mi aspetto una minore variabilità tra un clone e l’altro ma si

prendono comunque in considerazione almeno tre colonie

diverse di cui si vanno a saggiare i livelli di espressione

individuiamo e scegliamo il miglior clone di produzione.

Questa scelta si realizza comunque attraverso un lavoro di

 scale-up cioè la produzione di colture che abbiamo un volume

maggiore che ci consenta di osservare i livelli di espressione

della proteina target.

Il primo passaggio a questo punto sarà quindi quello di

 preinoculo in un volume che va solitamente da 2 a 10 ml di

terreno e si lascia in crescita e si lascia raggiungere una

densità cellulare controllata.

Successivamente si aumenta ulteriormente il volume

 realizzando una diluizione della coltura preinoculo può

essere 20-50 millilitri maggiore realizzo così un’inoculo della

coltura di produzione, quella in cui mi aspetto di fare delle

verifiche di produzione.

Questa coltura sarà a sua volta soggetta un’induzione

 utilizzando IPTG.

Questo percorso può essere fatto su piccola scala (50ml) se ho

 l’obbiettivo di verificare quali siano i livelli di produzione nelle

colture. È valido nel caso di ceppi di espressione di tipo

microbico (batterio, lievito).

Una volta individuato il clone produttivo posso ulteriormente

 aumentarne il volume. In scala di laboratorio la crescita delle

colture di produzione e di induzione avvengono in beuta

(erlenmeyer flasks= tipo specifico di beuta).

Durante queste espansioni della coltura bisogna tener conto

 che il volume operativo (della coltura di produzione che

utilizziamo nelle beute) non deve essere superiore ad un terzo

di quello nominale una beuta da 500ml non utilizzo più di

su

150 ml di coltura.

Questo rapporto va mantenuto perché durante la fase di

 produzione devo conservare delle condizioni operative che

riguardano non solo la composizione del terreno e la

temperatura, ma anche il grado di ossigenazione della coltura.

riempire la beuta implica il fatto che la regione di

non

scambio con l’ambiente (con l’O nell’aria) sia molto ridotta

2

rispetto al volume della coltura.

Queste beute sono tenute in agitazione, i cui termini sono

 rivoluzioni per minuto, perché vengono poste su oscillatori di

tipo orbitale su cui imposto le rivoluzioni per minuto (rpm) cioè

una rotazioni del piatto del dispositivo dalla velocità di

rotazione dipende il grado di ossigenazione della coltura.

La formazione di schiuma impedisce lo

scambio con l’ossigeno per cui per quanto

possibile si eviterà la formazione di

schiuma attraverso dei surfattanti che ne

impediscono la formazione (composti anti

foam)

La produzione in beute fino a 3L è il massimo che ci possiamo

 consentire quando si fa lo scale up in laboratorio

successivamente si fa lo scale up con dei fermentatori o

bioreattori che sono dispositivi che consentono il controllo di

tutti gli elementi che vogliamo controllare durante la

produzione di proteine ricombinanti. Il bioreattore è dotato di

una camici termostata che consente di controllare in modo

molto stretto la temperatura e di tracciare nel tempo tutte le

variazioni di temperatura a cui può essere andata in contro la

coltura. È controllata anche l’ossigenazione che dipende da un

sistema di agitazione (braccio mobile a cui sono collegate della

pale che ruotano). Posso anche controllare l’aggiunta di

nutrienti e del pH. Posso fare dei prelievi.