Modulo di Fisiopatologia

DIAGNOSTICA MOLECOLARE DI MALATTIE EMORRAGICHE E TROMBOTICHE

La coagulazione non è equivalente all'emostasi. Il sangue circola in un sistema chiuso - circolo sanguigno. Un taglio che rompe la continuità del sistema vasale fa uscire sangue - se la continuità non è riparata esce sangue. L'emostasi è il meccanismo fisiologico di ripristino di continuità. La coagulazione è una parte dell'emostasi. L'emostasi è un processo omeostatico che deve essere regolato - se funziona troppo abbiamo trombosi, se non funziona emorragia.

L'emostasi prevede quattro fasi:

1. danno endoteliale: con esposizione del connettivo sub endoteliale e formazione di un tappo piastrinico
2. coagulazione: le piastrine formano un tappo piastrinico (emostasi primaria) - aderiscono all'endotelio danneggiato. La coagulazione è la seconda fase dell'emostasi e avviene in modo parallelo alla fase

piastrinica e vascolare, è un processo di reazioni umorali a carico di pp del sangue volte alla creazione di un reticolo di fibrina → mette insieme il tappo piastrinico e altro nel chiudere la soluzione di continuità.- terminazione: il processo è regolato a livello locale → quando il processo raggiunge il suo scopo con feedback negativo i fattori antitrombotici evitano la propagazione. La parete vasale può ripararsi- fibrinolisi: rimozione del coagulo → taglio del reticolo in modo tale che le varie componenti siano liberate in circolo. Il coagulo è un fitto reticolo di fibrina in cui sono intrappolati globuli rossi e piastrine. Per vedere se un pz ha trombosi, oltre all'ecodoppler, si fa XDP → si va a vedere se ci sono prodotti di degradazione della fibrina, se sono aumentati è presente un coagulo.

PIASTRINE
Tra i vari protagonisti dell'emostasi ci sono le piastrine → una delle tre parti corpuscolate del sangue,

sono frammenti di cellule multinucleate (megacariocita nel midollo). Il megacariocita si replica per endomitosi, a partire dal citoplasma per gemmazione si formano le piastrine, il megacariocitasi trova nel midollo osseo. Sono immesse in circolo miliardi di piastrine. Bisogna mantenere un livello di piastrine nel sangue periferico tra le 150-450 miliardi per litro di sangue. Una piastrina ha vita di 7-10 giorni → ogni giorno 10-15% di piastrine da rimpiazzare. La milza serve come buffer di piastrine → del pool piastrinico circolante è sequestrato dalla milza ed è rilasciato in condizioni di bisogno velocemente. Il diametro di una piastrina è di 2-3 micron. Le piastrine sono altamente specializzate → la forma deriva dalla funzione. Le piastrine, circolando, rotolano e sondano l'endotelio. Un endotelio intatto ha uno strato continuo di cellule con specifici segnali, le piastrine quando rotolano trovano esposizione di spazio subendoteliale → ilconnettivo contiene pp: VWF. Quando la piastrina trova VWF si ferma → adesione: primarisposta piastrina all’esposizione del subendotelio. Le piastrine interagiscono con VWF tramite GpIB.Oltre alle piastrine che aderiscono al subendotelio ci sono piastrine che si aggregano ad altre piastrine → aggregazione con formazione del tappopiastrinico: prima risposta tridimensionale solida alla soluzione di continuità dell'endotelio del vaso. L’aggregazione piastrina-piastrina mediata dallegame di GpIIB/IIIA al fibrinogeno (proteina solubile del siero) e al VWF.Le piastrine hanno un ruolo attivo: nel citosol hanno granuli contenenti pp → l’aggregazione porta a degranulazione con rilascio di fibrinogeno, VWF eADP (fattore di attivazione delle piastrine) → feedforward che porta alla formazione del tappo piastrinico.Nei granuli ci sono pp che attivano la coagulazione:- VWF media l’interazione con l’endotelio e assieme al fibrinogeno

media anche l'interazione piastrina-piastrina- ADP attiva le piastrine- Fattori della coagulazione, fibrinogeno e calcio

A questo punto avviene la coagulazione (sono in contemporanea) → fenomeno che porta alla trasformazione del sangue da stato liquido a stato semisolido → serve il reticolo di fibrina. La coagulazione è mediata da pp plasmatiche → fattori della coagulazione: sono attive solo dove e quando serve. Le pp circolano altrimenti in stato inerti → proenzimi o pp inattivate. Quando arriva lo specifico stimolo si attivano.

COAGULAZIONE

La coagulazione fa sì che il fibrinogeno (pp globulare) diventi fibrina (pp lineare) in grado di legarsi testa-coda con altra fibrina → la trombina (IIa) taglia fibrinogeno a fibrina. In natura esistono decine di pp coinvolte a monte di questa reazione controllate e attivate in modo diverso. Il fattore II (o protrombina) viene attivato dal fattore Xa usando come cofattore Va. Il fattore X viene attivato in 2

modi diversi:

• via estrinseca
• via intrinseca

Le due vie differiscono per pp coinvolte e stimolo iniziale.

VIA ESTRINSECA

La via estrinseca richiede la presenza della proteina TF non presente nel plasma ma rilasciata da cellule del connettivo, che attiva il fattore VII che a sua volta attiva il fattore X. Il fattore tissutale non è una molecola singola ma sono dei complessi di proteine e fosfolipidi detti anche tromboplastine.

VIA INTRINSECA

La via intrinseca non richiede fattori esterni. Questo spiega perché il sangue prelevato e messo in tubi coaguli senza stimoli esterni, infatti nel tubo manca endotelio e segnali anticoagulanti.

Nella via intrinseca si ha l'attivazione sequenziale dei fattori XII-XI-IX per convergere nell'attivazione del fattore X (attivato dal fattore IX e VIII attivati).

Il fattore XII è attivato da proteine plasmatiche quali il chininogeno ad alto peso molecolare e la callicreina. Vi è un'attivazione basale della via intrinseca.

controbilanciata da fattori inibitori. A seguito del danno vasale l'equilibrio si sposta verso i fattori pro-coagulanti causando l'attivazione dellavia intrinseca.

Il Ca2+ e i fosfolipidi sono cofattori essenziali della maggior parte delle reazioni di attivazione dei fattori della coagulazione.

TEST SULLA FUNZIONALITÀ DELLA CASCATA COAGULATIVA

Ci sono 2 modi di valutare la funzionalità della cascata coagulativa:

1. Tempo di protrombina (PT) →valuta la via estrinseca (Fattore VII)
2. Tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) → valuta la via intrinseca (Fattori XII, XI, IX, VIII, chininogeno e precallicreina)

La fase terminale comune viene esplorata da entrambi i test. Quindi fattori X, V, protrombina e fibrinogeno. L'allungamento dei tempi riflette il deficitdei fattori in base al test utilizzato.

Questi test misurano solo l'attività delle proteine della coagulazione, ossia il processo coagulativo, ma l'emostasi parte

Dall'esposizione del danno endoteliale. Le piastrine non sono misurate come attività, l'unico test che misura anche la funzione piastrinica è il tempo di emorragia - test definitivo per capire se il paziente ha tendenza al sanguinamento, ma è poco sensibile e specifico. Mette insieme tutti i tempi di emostasi.

TEMPO DI EMORRAGIA

Si fa un taglio di lunghezza e profondità standardizzata, in una sede standardizzata, con un orientamento della lama standardizzato e con un dischetto si misura la grandezza della goccia di sangue, girando il dischetto tot volte ogni unità di tempo fino a che l'emorragia si ferma. È l'unico test che cattura l'interezza del processo emostatico ma è però inficiato da diverse variabili che talvolta lo rendono scarsamente attendibile. Viene effettuato molto raramente.

TEMPO DI PROTROMBINA

PT (o tempo di Quick) è il tempo che ci mette il plasma citrato a coagulare dopo che si aggiunge

calcio e tromboplastina. Il sodio-citrato è una molecola che chela il calcio. Per far sì che il sangue in provetta non coaguli si riveste la provetta di sodio citrato che, sequestrando il Ca2+, impedisce la coagulazione. Il plasma si ottiene a seguito della centrifugazione di un campione di sangue a seguito dell'aggiunta di un anticoagulante. Il plasma contiene la maggior parte delle proteine solubili, tra cui i fattori della coagulazione. Il siero si ottiene a seguito di centrifugazione di sangue in assenza di anticoagulanti. In questo caso la fase liquida che si ottiene non contiene le proteine della coagulazione in quanto entreranno a far parte del coagulo. Il siero è ottimo per studiare le concentrazioni di sostanze come: la creatinina, ormoni, sali, lipidi, azoto. Il siero è il plasma senza le proteine della coagulazione. Per valutare la via estrinseca al plasma citrato aggiungo Ca++ e il fattore tissutale (o tromboplastina) e osservo il tempo che ilplasma impiega per passare da liquido a semi-solido. Il reticolo di fibrina sarà visibile ad occhio nudo, con un cambio di colore e consistenza. È un test che fino a venti anni fa non era standardizzato, ovvero la tromboplastina disponibile ai vari laboratori non aveva tutta la stessa attività, quindi tromboplastine diverse davano risultati diversi. Oggi viene fatta la misurazione dell'INR (International Normalized Ratio). Questo usa un reagente standardizzato (tromboplastine standardizzate, cioè ad ogni tromboplastina viene dato un numero che riflette la sua efficacia nell'attivare il fattore VII) e rende il tempo di protrombina comparabile tra vari laboratori. INR è un rapporto misurato tra il tempo di coagulazione di un soggetto sano e il tempo di un soggetto test (1 ok, >1 lento, <1 veloce). È importante valutare il tempo di protrombina. Si rileva un aumento del PT in condizioni come: - patologie del fegato - DIC - CoagulazioneIntravasale Disseminata →attivazione del sistema coagulativo in modo improprio e diffuso nel circolo- deficit di vitamina K- deficit fattori di coagulazione (V, VII, X)- Trattamento con anticoagulanti come Valfarin o Cumadin (che agiscono sequestrando la vitamina K). La misura della PT è essenziale perdosare correttamente il farmaco.TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATAaPPT si usa per valutare la via intrinseca della coagulazione. Si parte da plasma citrato (che non coagula perché manca il Ca2+) e si aggiunge Ca++ etromboplastine parziali (fosfolipidi, molecole simili a chininogeno ad alto PM o precallicreina) in concentrazioni saturanti, questo porta all'attivazionedel fattore XII, che attiverà il fattore XI etc. e si misura il tempo di coagulazione. 2aPTT valuta l'attività di proteine della coagulazione come il fattore XII, XI, IX, VIII. Deficit di questi fattori porta a un allungamento dell'aPTT. Tra lemalattie da deficit difattore chiave nella produzione dei fattori coagulativi della via intrinseca- Deficit congenito di vitamina K, necessaria per la sintesi dei fattori coagulativi- Malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico, che possono causare la formazione di anticorpi contro i fattori coagulativi- Farmaci anticoagulanti come l'eparina, che inibiscono l'attività dei fattori coagulativi- Malattie infiammatorie croniche come l'artrite reumatoide, che possono influenzare la produzione e la funzione dei fattori coagulativi.