Modulo di Fisiopatologia

Fisiopatologia medica bolle

Diagnostica molecolare di malattie emorragiche e trombotiche

Emostasi

La coagulazione non è equivalente all'emostasi. Il sangue circola in un sistema chiuso → circolo sanguigno. Un taglio che rompe la continuità del sistema vasale fa uscire sangue → se la continuità non è riparata esce sangue. L'emostasi è il meccanismo fisiologico di ripristino di continuità. La coagulazione è una parte dell'emostasi. L'emostasi è un processo omeostatico che deve essere regolato → se funziona troppo abbiamo trombosi, se non funziona emorragia.

L'emostasi prevede quattro fasi:

• Danno endoteliale: con esposizione del connettivo sub-endoteliale e formazione di un tappo piastrinico
• Coagulazione: le piastrine formano un tappo piastrinico (emostasi primaria) → aderiscono all'endotelio danneggiato. La coagulazione è la seconda fase dell'emostasi e avviene in modo parallelo alla fase piastrinica e vascolare, è un processo di reazioni umorali a carico di pp del sangue volte alla creazione di un reticolo di fibrina → mette insieme il tappo piastrinico e altro nel chiudere la soluzione di continuità.
• Terminazione: il processo è regolato a livello locale → quando il processo raggiunge il suo scopo con feedback negativo i fattori antitrombotici evitano la propagazione. La parete vasale può ripararsi.
• Fibrinolisi: rimozione del coagulo → taglio del reticolo in modo tale che le varie componenti siano liberate in circolo. Il coagulo è un fitto reticolo di fibrina in cui sono intrappolati globuli rossi e piastrine. Per vedere se un pz ha trombosi, oltre all'ecodoppler, si fa XDP → si va a vedere se ci sono prodotti di degradazione della fibrina, se sono aumentati è presente un coagulo.

Piastrine

Tra i vari protagonisti dell'emostasi ci sono le piastrine → una delle tre parti corpuscolate del sangue, sono frammenti di cellule multinucleate (megacariocita nel midollo). Il megacariocita si replica per endomitosi, a partire dal citoplasma per gemmazione si formano le piastrine, il megacariocita si trova nel midollo osseo. Sono immesse in circolo miliardi di piastrine. Bisogna mantenere un livello di piastrine nel sangue periferico tra le 150-450 miliardi per litro di sangue. Una piastrina ha vita di 7-10 gg → ogni giorno 10-15% di piastrine da rimpiazzare. La milza serve come buffer di piastrine → del pool piastrinico circolante ¼ è sequestrato dalla milza ed è rilasciato in condizioni di bisogno velocemente. Il diametro di una piastrina è di 2-3 micron. Le piastrine sono altamente specializzate → la forma deriva dalla funzione.

Le piastrine, circolando, rotolano e sondano l'endotelio. Un endotelio intatto ha uno strato continuo di cellule con specifici segnali, le piastrine quando rotolano trovano esposizione di spazio subendoteliale → il connettivo contiene pp: VWF. Quando la piastrina trova VWF si ferma → adesione: prima risposta piastrina all'esposizione del subendotelio. Le piastrine interagiscono con VWF tramite GpIB.

Oltre alle piastrine che aderiscono al subendotelio ci sono piastrine che si aggregano ad altre piastrine → aggregazione con formazione del tappo piastrinico: prima risposta tridimensionale solida alla soluzione di continuità dell'endotelio del vaso. L'aggregazione piastrina-piastrina mediata dal legame di GpIIB/IIIA al fibrinogeno (proteina solubile del siero) e al VWF.

Le piastrine hanno un ruolo attivo: nel citosol hanno granuli contenenti pp → l'aggregazione porta a degranulazione con rilascio di fibrinogeno, VWF e ADP (fattore di attivazione delle piastrine) → feedforward che porta alla formazione del tappo piastrinico.

Nei granuli ci sono pp che attivano la coagulazione:

• VWF media l'interazione con l'endotelio e assieme al fibrinogeno media anche l'interazione piastrina-piastrina
• ADP attiva le piastrine
• Fattori della coagulazione, fibrinogeno e calcio

A questo punto avviene la coagulazione (sono in contemporanea) → fenomeno che porta alla trasformazione del sangue da stato liquido a stato semisolido → serve il reticolo di fibrina. La coagulazione è mediata da pp plasmatiche → fattori della coagulazione: sono attive solo dove e quando serve. Le pp circolano altrimenti in stato inerti → proenzimi o pp inattivate. Quando arriva lo specifico stimolo si attivano.

Coagulazione

La coagulazione fa sì che il fibrinogeno (pp globulare) diventi fibrina (pp lineare) in grado di legarsi testa-coda con altra fibrina → la trombina (IIa) taglia fibrinogeno a fibrina. In natura esistono decine di pp coinvolte a monte di questa reazione controllate e attivate in modo diverso.

Il fattore II (o protrombina) viene attivato dal fattore Xa usando come cofattore Va. Il fattore X viene attivato in 2 modi diversi:

• Via estrinseca
• Via intrinseca

Via estrinseca

La via estrinseca richiede la presenza della proteina TF non presente nel plasma ma rilasciata da cellule del connettivo, che attiva il fattore VII che a sua volta attiva il fattore X. Il fattore tissutale non è una molecola singola ma sono dei complessi di proteine e fosfolipidi detti anche tromboplastine.

Via intrinseca

La via intrinseca non richiede fattori esterni. Questo spiega perché il sangue prelevato e messo in tubi coaguli senza stimoli esterni, infatti nel tubo manca endotelio e segnali anticoagulanti. Nella via intrinseca si ha l'attivazione sequenziale dei fattori XII-XI-IX per convergere nell'attivazione del fattore X (attivato dal fattore IX e VIII attivati). Il fattore XII è attivato da proteine plasmatiche quali il chininogeno ad alto peso molecolare e la callicreina. Vi è un'attivazione basale della via intrinseca, controbilanciata da fattori inibitori. A seguito del danno vasale l'equilibrio si sposta verso i fattori pro-coagulanti causando l'attivazione della via intrinseca. Il Ca²⁺ e i fosfolipidi sono cofattori essenziali della maggior parte delle reazioni di attivazione dei fattori della coagulazione.

Test sulla funzionalità della cascata coagulativa

Ci sono 2 modi di valutare la funzionalità della cascata coagulativa:

• Tempo di protrombina (PT) → valuta la via estrinseca (Fattore VII)
• Tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) → valuta la via intrinseca (Fattori XII, XI, IX, VIII, chininogeno e precallicreina)

La fase terminale comune viene esplorata da entrambi i test. Quindi fattori X, V, protrombina e fibrinogeno. L'allungamento dei tempi riflette il deficit dei fattori in base al test utilizzato. Questi test misurano solo l'attività delle proteine della coagulazione, ossia il processo coagulativo, ma l'emostasi parte dall'esposizione del danno endoteliale. Le piastrine non sono misurate come attività, l'unico test che misura anche la funzione piastrinica è il tempo di emorragia → test definitivo per capire se il pz ha tendenza al sanguinamento, ma è poco sensibile e specifico. Mette insieme tutti i tempi di emostasi.

Tempo di emorragia

Si fa un taglio di lunghezza e profondità standardizzata, in una sede standardizzata, con un orientamento della lama standardizzato e con un dischetto si misura la grandezza della goccia di sangue, girando il dischetto tot volte ogni unità di tempo fino a che l'emorragia si ferma. È l'unico test che cattura l'interezza del processo emostatico ma è però inficiato da diverse variabili che talvolta lo rendono scarsamente attendibile. Viene effettuato molto raramente.

Tempo di protrombina

PT (o tempo di Quick) è il tempo che ci mette il plasma citrato a coagulare dopo che si aggiunge calcio e tromboplastina. Il sodio-citrato è una molecola che chela il calcio. Per far sì che il sangue in provetta non coaguli si riveste la provetta di sodio citrato che, sequestrando il Ca²⁺, impedisce la coagulazione. Il plasma si ottiene a seguito della centrifugazione di un campione di sangue a seguito dell'aggiunta di un anticoagulante. Il plasma contiene la maggior parte delle proteine solubili, tra cui i fattori della coagulazione. Il siero si ottiene a seguito di centrifugazione di sangue in assenza di anticoagulanti. In questo caso la fase liquida che si ottiene non contiene le proteine della coagulazione in quanto entreranno a far parte del coagulo. Il siero è ottimo per studiare le concentrazioni di sostanze come: la creatinina, ormoni, sali, lipidi, azoto. Il siero è il plasma senza le proteine della coagulazione.

Per valutare la via estrinseca al plasma citrato aggiungo Ca⁺⁺ e il fattore tissutale (o tromboplastina) e osservo il tempo che il plasma impiega per passare da liquido a semi-solido. Il reticolo di fibrina sarà visibile ad occhio nudo → cambio di colore e consistenza. È un test che fino a venti anni fa non era standardizzato, ovvero la tromboplastina disponibile ai vari laboratori non aveva tutta la stessa attività → tromboplastine diverse davano risultati diversi. Oggi viene fatta la misurazione dell'INR (International Normalized Ratio). Questo usa un reagente standardizzato (tromboplastine standardizzate, cioè ad ogni tromboplastina viene dato un numero che riflette la sua efficacia nell'attivare il fattore VII) e rende il tempo di protrombina comparabile tra vari laboratori. INR è un rapporto misurato tra il tempo di coagulazione di un soggetto sano e il tempo di un soggetto test (1 ok, >1 lento, <1 veloce). È importante valutare il tempo di protrombina. Si rileva un aumento del PT in condizioni come:

• Patologie del fegato
• DIC - Coagulazione Intravasale Disseminata → attivazione del sistema coagulativo in modo improprio e diffuso nel circolo
• Deficit di vitamina K
• Deficit fattori di coagulazione (V, VII, X)
• Trattamento con anticoagulanti come Valfarin o Cumadin (che agiscono sequestrando la vitamina K). La misura della PT è essenziale per dosare correttamente il farmaco.

Tempo di tromboplastina parziale attivata

aPTT si usa per valutare la via intrinseca della coagulazione. Si parte da plasma citrato (che non coagula perché manca il Ca²⁺) e si aggiunge Ca⁺⁺ e tromboplastine parziali (fosfolipidi, molecole simili a chininogeno ad alto PM o precallicreina) in concentrazioni saturanti, questo porta all'attivazione del fattore XII, che attiverà il fattore XI etc. e si misura il tempo di coagulazione. aPTT valuta l'attività di proteine della coagulazione come il fattore XII, XI, IX, VIII. Deficit di questi fattori porta a un allungamento dell'aPTT.

Tra le malattie da deficit di fattori coagulativi della via intrinseca (la PT normale) ci sono:

• DIC, in cui vengono consumati tutti i fattori della coagulazione → allungamento di entrambi i tempi
• Emofilia A e B, malattie genetiche da deficit di fattori coagulativi della via intrinseca
• Epatopatie gravi → il fegato è l'organo dove la gran parte di questi fattori coagulativi sono sintetizzati
• VWD, malattia di von Willebrand
• Deficit di fattori IX, XI, XII, VIII

Quando veniva somministrata l'eparina sodica veniva misurato l'aPTT in quanto questa causava un aumento dei tempi e perciò il test veniva sfruttato per dosare il farmaco. L'eparina agisce infatti come attivatore di un fattore anticoagulante che lavora principalmente sulla via intrinseca. Oggi vengono usate altre forme di eparina che non alterano i tempi di coagulazione.

Tempo di trombina

Il tempo di trombina è un test dove il plasma citrato viene addizionato di trombina. Questo test permette di valutare se in quel plasma c'è il fibrinogeno perché vengono bypassate via intrinseca ed estrinseca. Questo viene usato per cercare deficit congeniti di fibrinogeno (rari) o deficit acquisiti (soprattutto in situazioni di DIC e epatopatia grave). È poco usato perché non ha grande utilità clinica. L'eparina inibisce anche la trombina per cui si avrà un prolungamento della PT.

Malattie emorragiche

Malattie dove il processo di emostasi non è efficiente ed il soggetto tende a sanguinare più del dovuto. Sono piuttosto prevalenti nella popolazione generale (200 casi/mln di abitanti). Esistono:

• Patologie a carico del sistema coagulativo, le numericamente più importanti, dovute ad alterazioni dei fattori della coagulazione. Tra queste, la malattia di von Willebrand, l'emofilia A e l'emofilia B
• Patologie a carico delle piastrine (piastrinopatie) in cui si rilevano alterazioni del contenuto in granuli o alterazioni strutturali o ancora nei recettori delle piastrine

Emofilia A

È una malattia ereditaria genetica e congenita, trasmessa come carattere recessivo legato al cr X, dovuta a una deficienza del fattore VIII. Ha prevalenza nei maschi (1:10.000). Deriva da un numero vario ed eterogeneo di difetti del fattore VIII. I problemi clinici si riscontrano quando tale fattore VIII ha attività residua sotto al 5% → l'organismo mantiene un'importante riserva funzionale.

Abbiamo tre forme cliniche:

• Emofilia grave: attività coagulante del fattore carente < 1%. Frequenti gravi emorragie spontanee articolari, muscolari, d'organo. Incidenza relativa 50%
• Emofilia intermedia: attività coagulante del fattore carente tra 1% e 5%. Rare emorragie spontanee, sanguinamento post-traumatico. Incidenza relativa 30%.
• Emofilia lieve: attività coagulante del fattore carente > 5%. Sanguinamento solo dopo trauma grave o post-operatorio. Incidenza relativa 20%

Una donna può essere emofilica se ha la sindrome di Turner, quindi se ha un solo cromosoma X oppure se nasce da genitori consanguinei.

Patogenesi molecolare

Il gene per il fattore VIII è localizzato nella parte terminale del braccio lungo del cromosoma X (Xq28). Ci sono centinaia di difetti e mutazioni differenti. Si possono verificare riarrangiamenti del DNA come inversioni dell'intera sequenza genica tra l'esone 1 e l'esone 22 che portano ad abrogazione del gene e quindi a mancata produzione del prodotto genico (40% dei casi di emofilia grave). Ci possono essere fenomeni più lievi come piccole delezioni (di 100 o più nt), inserzioni e duplicazioni sono compatibili con una produzione parziale della proteina che mostra una certa attività residua. Sono piuttosto rare le mutazioni puntiformi o le piccole delezioni sotto i 100 nucleotidi.

Diagnosi

I sanguinamenti ritardati sono a carico della componente coagulativa mentre sanguinamenti immediati sono piastrinici. Si fa l'anamnesi. Si esegue aPTT e si verifica se i tempi sono allungati → potrebbero essere a carico di alterazione di più fattori di coagulazione. Bisogna dosare l'attività dei fattori (VIII, IX, XI, XII) uno per uno per trovare quello con attività ridotta. Il test genetico può essere effettuato durante la gravidanza, tramite amniocentesi o analisi dei villi coriali per rilevare se il feto è affetto oppure no. Il test genetico può essere anche fatto nella diagnosi pre-impianto, nell'ambito della fecondazione assistita, per scegliere eventuali ovuli fecondati che non abbiano la mutazione. Il tempo di emorragia nei pazienti emofilici è normale in quanto le piastrine in una paziente emofilico sono normali e permettono la formazione di un tappo piastrinico.

Sintomi

Si formano ematomi a livello dell'articolazione (emartri). Questo causa infiammazione cronica e artriti. Spesso bisogna ricorrere a protesi di anca e ginocchio in età molto precoce.

Emofilia B

Malattia ereditaria trasmessa come carattere recessivo legato al cr X, dovuta a deficienza del fattore IX. Ha le stesse caratteristiche cliniche dell'emofilia A.